第三节 常用的基因筛查技术
一、染色体核型分析
染色体核型分析是指将待测细胞的染色体依照该生物固有的染色体形态结构特征，按照一定的规定，人为地对其进行配对、编号和分组，并进行形态分析的过程。其基本原理是不同物种的染色体都有各自特定且相对稳定的形态结构（包括染色体的数目、长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）。染色体经染色或荧光标记后，通过一定的光学或电化学显色设备就可以清晰而直观地观察其具体形态结构，与正常核型进行对比寻找差异，进而确定染色体的数目，以及判断是否出现缺失、重复和倒置等现象。传统的染色体核型分析技术主要为染色体显带技术，是利用Giemsa染料通过特殊的染色方法使染色体的不同区域着色，使染色体在光镜下呈现出深浅交替的带纹，即为染色体带型。每条染色体都有特定的带型。根据染色体的不同带型，可以细致而可靠地识别每条染色体。如果染色体带型发生变化，则表示该染色体的结构发生了改变。目前常用的染色体显带技术有G显带（最常用）、Q显带、R显带、T显带（末端显带）、C显带（着丝粒显带）等。
临床应用与评价：染色体数目和结构上的异常被称为染色体异常，由染色体异常引起的疾病称为染色体病。目前发现的染色体病已有100多种，如21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征、特纳综合征、精曲小管发育不全、猫叫综合征、脆性X染色体综合征等。染色体病在临床上可导致唐氏综合征、先天性多发性畸形及癌症等；在早期自然流产时，50%～60%是由染色体异常所致。染色体核型分析的目的就是发现染色体异常，诊断染色体病，将其应用于产前诊断可降低染色体平衡易位、倒位等导致的畸形胎儿的出生率，同时可对不孕症、多发性流产、畸胎等孕产史的夫妇和多发畸形等患者进行遗传学诊断。
二、染色体基因组芯片技术
染色体基因组芯片，又称DNA芯片、DNA微阵列、寡核苷酸阵列，是生物芯片技术中实用性最强、最先投入应用的技术之一。基因芯片技术是结合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，以大量人工合成或应用常规分子生物学技术获得核酸片段作为探针，采用原位合成或合成点样方法将探针密集、规律地或按特定的排列方式固定在硅片、尼龙膜、塑料或玻璃等支撑载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵。其主要原理是核酸分子杂交技术，即利用核酸分子碱基之间互补配对的原理，将处理好的样品与固定到固体支持物上的核苷酸进行杂交，通过激光共聚焦扫描及分析软件，以实现对待测样品的大规模检测。
临床应用与评价：相比传统核酸印迹杂交技术，染色体基因组芯片具有快速、准确、灵敏、信息量大，可同时检测多种疾病、操作简单、重复性强等明显优势，故在遗传性疾病诊断和出生缺陷检测领域具有非常重要的应用价值。目前，基因芯片技术在临床上的应用主要有两种技术形式，一种是比较基因组杂交芯片（array-based comparative genomic hybridization，aCGH），其基本原理是将受检者样本基因组DNA与正常对照样本基因组DNA用限制性内切酶酶切片段化后，分别标记上不同颜色的荧光，同时与芯片上固定探针进行竞争性杂交，通过芯片扫描和数据分析，获得受检者样本的基因组拷贝数变化情况和染色体异常情况。另一种是单核苷酸多态性微阵列芯片（single nucleotide polymorphism array，SNP array），其基本原理是将大量的SNP检测探针用特殊方法固定在硅芯片上，获得高密度的SNP微阵列，将受检者样本基因组DNA和芯片上的探针进行杂交，通过单碱基延伸在探针的3'末端掺入不同荧光标记的双脱氧核苷酸，通过荧光信号扫描和相关软件，分析受检者样本的拷贝数变化及基因型等。与aCGH技术相比，SNP芯片除了能检测拷贝数变异外，还能够检出杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）和一定比例的嵌合体。需要指出的是，SNP芯片检测拷贝数变异的准确性不如aCGH芯片。目前已有兼具aCGH芯片检测探针（用于拷贝数变化检测）和SNP芯片探针（用于检测SNP）的芯片，可同时对受检者样本进行准确的拷贝数分析和杂合性缺失分析。
aCGH芯片和SNP芯片等染色体基因组芯片可在全基因组范围内同时检测多种染色体不平衡导致的疾病，其临床应用指征包括不明原因的智力落后和/或发育迟缓、非已知综合征的多发畸形及孤独症谱系障碍等。与常规染色体核型分析相比，染色体基因组芯片技术无需细胞培养，通量高，分辨率高出近千倍，可用于几乎任何组织的DNA分析，可为临床医生提供更详细和明确的染色体检查结果。需要注意的是，染色体基因组芯片技术也具有一定的局限性，无法检测平衡易位、倒位、复杂重排等染色体结构性变异，不能检测低水平嵌合（＜ 10%）及点突变、小片段插入/缺失等。
三、Sanger测序（一代测序）
Sanger测序技术，也称第一代测序技术，该技术始于1977年美国生物化学家Frederick Sanger发明的双脱氧末端终止法以及Maxam和Gilbert发明的化学裂解法。其基本原理是一个DNA聚合反应，以待测单链DNA为模板，与模板的起始序列互补的引物与DNA模板特异性结合后，4种脱氧核苷酸dNTP在DNA聚合酶作用下延伸引物，从而合成与模板互补的新的DNA链。在这个反应体系中，除了4种dNTP，还引入了一定比例的带不同荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP。由于保留了5'-OH基团，ddNTP可以被聚合酶结合掺入到DNA链当中和上一个dNTP的磷酸基团形成磷酸二酯键，但因缺乏3'-OH，无法和下一个dNTP的磷酸基团形成磷酸二酯键，所以DNA链的延伸就此终止。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上。测序产物是长度相差一个碱基的一系列片段，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳分离大小不等的片段，并通过荧光标记识别片段末端碱基，从而获得所测片段的碱基序列。
临床应用与评价：Sanger测序技术测序读长相对长、准确性高，测序结果直观可视，不用建库因而假阳性结果极低，是目前检测DNA序列的金标准。但其也有明显的临床应用缺陷，如灵敏度较低、通量小、成本相对高。在目前高通量测序已经日趋成熟的时代，Sanger测序技术进行遗传学诊断和产前诊断的应用价值主要在于那些临床诊断比较明确（如对新生儿筛查PKU阳性的婴儿做PAH基因的检测），遗传及位点异质性不强的疾病（如临床诊断或家族史提示囊性纤维化的患者做CFTR基因的检测），特别是有变异热点的基因（如对软骨发育不全的患者进行FGFR3基因1 138位点的测序进行目标性的检测）。Sanger测序目前也已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和治疗等临床实践中。如对BRCA基因或APC基因的检测分析，可用于早期发现乳腺癌或结肠癌的易感人群，从而对这些人群采取必要的干预措施。Sanger测序还可以对肿瘤靶向治疗药物相关基因的突变位点进行检测，如在非小细胞肺癌的治疗中，使用靶向药前必须要检测EGFR基因的状态，可以针对EGFR基因突变热点所在几个外显子设计特异性扩增和测序引物进行直接测序。Sanger测序不仅适用于对家族其他成员进行已知家族性特异变异的检测，还是高通量测序基因检测筛选单基因遗传病家系致病基因后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。
四、高通量测序技术
高通量测序技术即NGS，是对传统一代测序技术的革命性改变，相比于第一代测序的通量提高了成千上万倍，甚至上亿倍。该技术主要基于边合成边测序或边连接边测序的基本原理，一次实现对数百万个DNA分子同时测序；也可实现对一个物种的基因组和转录组进行深入细致的全貌分析，因而又被称为深度测序。目前市场上的高通量测序仪主要包括具有不同通量、读长及研究适配的测序仪器。测序时应根据检测的样本量和质量要求，确定适宜的测序平台与方案，以保证测序数据能够满足质量及靶向区域覆盖度等需求。相较于传统的Sanger测序，高通量测序技术在原理、操作细节、技术扩展方面有着巨大优势。
临床应用与评价：与一代测序相比，高通量测序的独特优势在于：①大规模平行测序，通量高；②有定量功能，即样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度，可对基因组拷贝数进行分析；③成本低廉，单碱基测序费用较Sanger测序急剧下降。NGS技术对同时涉及多个基因、多种变异类型，以及罕见变异的出生缺陷和遗传性疾病的分子诊断具有非常明显的优势，在鉴定疾病致病基因方面也非常有效。
NGS技术按其复杂程度由低到高、检测对象由少到多可分为三个不同的分析水平，即疾病靶向基因包panel测序、WES及WGS。疾病靶向基因包测序主要用于以下几个情况：①具有很大遗传异质性的临床表型，如耳聋基因包；②需要进行分辨诊断的临床表现类似的疾病，如心肌病基因包；③不同疾病共享一种临床表现的情况，如癫痫基因包；④同一个信号转导系统里面的基因，如Rasopathy基因包检测努南综合征。由于其只检测部分基因，测序深度高，因而分析的灵敏度和特异度较高，且因针对已知的致病基因进行测序，故结果解释相对容易。WES是一种针对基因组中所有编码区域的测序方法。外显子组虽然只占基因组的1%～2%，但目前发现约85%的致病突变位于外显子。WES除了能检测已知疾病相关基因突变外，新近发现的致病基因也会得到检测，同时还能发现新的候选致病基因，是临床表型复杂/不特异、临床诊断不明的病例，以及尚未出现临床表型病例的理想检测手段，也是发现新致病基因的有效策略。WGS测序同时覆盖编码和非编码区域，其测序样品制备简单，不需要靶区域的PCR或杂交富集。由于目前对于非编码区域的变异解释尚不理想，所以通常先对编码区进行分析，如果编码区未发现致病突变，则可对数据进行重新分析，寻找非编码区域的调控序列是否发生变异。此外，WGS数据也可用于拷贝数变异（copy number variation，CNV）、AOH 及平衡易位等结构变异的分析。目前因WGS测序成本比较高，且WGS测序产生的数据庞大，数据分析复杂，因此WGS应用于临床检测尚不成熟。
五、其他遗传学技术
（一）多重连接探针扩增技术
多重连接探针扩增技术（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）于 2002 年由Schouten等首先报道，是近几年发展的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。MLPA是多重PCR的一种形式，该技术针对特定基因组靶区域设计多个长度不等的寡核苷酸探针对，利用探针对外侧的通用引物对，同时扩增多个基因组靶区域，扩增信号的强度反应靶区域的量（即为拷贝数）。MLPA可分为5个主要步骤：DNA变性和MLPA探针杂交；连接反应；PCR反应；电泳分离扩增产物；数据分析。在第一步中，DNA变性后与MLPA探针混合液孵育过夜。MLPA探针由两条单独的寡核苷酸构成，每条均含有一段PCR引物序列。两个探针寡核苷酸直接杂交到邻近目标序列。只有当两条探针寡核苷酸都杂交到邻近目标区域的时候，它们才能在连接反应中被连接起来。只有连接起来的探针才能在接下来的PCR反应中以指数方式扩增，探针连接产物的数量是样本中目标序列数量的量度标准。用毛细管电泳将扩增产物进行分离。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
临床应用与评价：MLPA的主要用途是对目标区域的基因序列拷贝数进行检测，可经济、高效、快速地检测一些已知基因组拷贝数变异的常见遗传病，如1p36缺失综合征、威廉姆斯综合征、史密斯-马盖尼斯综合征、米勒-迪克尔综合征、迪格奥尔格综合征等。另外，临床疑似脊髓性肌萎缩的患者，实验室检测首先考虑用针对SMN1、SMN2基因的MLPA检测，因95%以上的脊髓性肌萎缩是由SMN1基因7、8号外显子缺失所导致。MLPA还可以对由表观遗传异常导致的疾病，如普拉德-威利综合征或快乐木偶综合征进行甲基化检测（MS-MLPA）。
（二）荧光原位杂交
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光素取代放射性核素标记探针而形成的一种新的原位杂交方法，以检测分裂中期染色体或间期染色质数目和结构。其基本原理是利用特殊标记的DNA（或RNA）探针，与中期染色体直接杂交，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体特异性结合，对染色体DNA序列进行定性、定位和定量分析，以鉴定染色体的数目和基因组结构是否异常。
临床应用与评价：FISH技术具有稳定、实验周期短、特异度好、定位准确等特点。在遗传病诊断和产前诊断领域，FISH仍是筛查染色体病的主要方法之一，主要用来筛查染色体非整倍体特别是13、18、21、X和Y染色体的数目异常，以及染色体结构异常包括微小缺失、微小重排等。FISH可利用未培养的羊水间期细胞进行染色体异常检测，不仅能够克服传统的羊水细胞遗传学诊断无法克服的局限性，如取材时间有限、耗时时间长、结果取决于中期分裂象多少等，还排除了因培养造成的假嵌合体现象。FISH可利用绒毛样本对染色体病进行早期产前诊断，相比常规染色体分析，FISH所分析的细胞数目及细胞来源（来自绒毛不同组织）较多，增加了诊断的可靠性，同时能得到更多的数据来做出正确的统计分析。FISH技术也可以应用于胚胎植入前遗传学诊断PGD中，以鉴定胎儿的性别，排除性染色体连锁疾病的发生；检测染色体的非整倍性和染色体结构畸变，大大降低了妊娠自然流产和患儿出生的概率。