必 备 知 识

一、外植体的选择

外植体是植物组织培养中的各种接种材料。迄今为止，经组织培养成功的植物所使用的外植体几乎包括了植物体的各个部位，如根、茎、叶、花瓣、花药、胚珠、幼胚、块茎、茎尖、维管组织、髓部、细胞和原生质等。

从理论上讲，植物细胞都具有细胞全能性，若条件适宜，都能再生成完整植株，但实际上，植物种类不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理状态，对外界诱导反应的能力及分化再生能力是不同的。因此，选择适宜的外植体需要从以下几个方面考虑。

1．植物基因型

植物基因型不同，组织培养的难易程度不同，如草本植物易于木本植物，双子叶植物易于单子叶植物。同时植物基因型不同，组织培养的再生途径也不同，如十字花科植物中的胡萝卜、芥菜易于诱导胚状体。茄科中的烟草、番茄易于诱导愈伤组织。

2．外植体来源与选择部位

从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作为外植体，离体培养易于成功。因为这部分器官或组织代谢旺盛、再生能力强。同一植物不同部位之间再生能力差别较大，如百合鳞茎的外层鳞片比内层鳞片的再生能力强，下段比上段和中段的再生能力强。因此，最好对要培养的植物的各个部位的诱导和分化能力进行比较，从中选择合适的、最易再生的部位作为外植体。对于大多数植物来说，茎尖是最好的外植体。

3．外植体大小

取材的大小根据培养的目的而定。如果是胚胎培养或脱毒，则外植体宜小；如果是进行快繁，外植体宜大。但过大，灭菌不彻底，易于污染；过小离体培养难以成活。一般外植体大小在0.5～1.0cm为宜。

4．取材时期

植物组织培养取材时要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。离体培养的外植体最好在植物生长的最适时期取材，即在其生长开始的季节采样，若在生长末期或已经进入休眠期取样，则外植体会对诱导反应迟钝或无反应。如苹果芽培养最好在春季取材。百合鳞片外植体最好在春、秋季节取材。花药培养则一般在花粉粒发育到单核期进行取材。

5．外植体的生理状态和发育年龄

外植体的生理状态和发育年龄直接影响离体培养过程中的形态发生。一般情况下，越幼嫩、年限越短的组织具有较高的形态发生能力，组织培养越易成功。

二、外植体的处理与灭菌

（一）外植体的处理

从田间取回的离体材料，往往带有较多的泥土、杂菌，不宜直接接种，需要对材料进行预处理和必要的修整。预处理一般采用喷杀虫剂、杀菌剂及套袋、室内盆栽等方法。如针对在室外株型较大的木本植株上确定好外植体后，可对选取的部位喷杀虫剂和杀菌剂，然后套上塑料袋，待长出新枝条后，再进行外植体采样。而针对小型草本植物可剪除一些不必要的枝条后将其栽植到花盆中，在室内或置于人工气候室内培养。预处理后的外植体在灭菌前，还要进行必要的修剪，去掉不需要的部分。

（二）外植体的灭菌

1．常用的灭菌剂

经过预处理的材料，其表面仍有很多的细菌和真菌。因此，在接种前必须进行表面灭菌。由于植物种类、取材部位、母体植株的生态环境、取材季节和天气状况的不同，所采集的材料带菌程度也不同，而且材料对不同种类、不同浓度的灭菌剂的敏感度也不一样。所以，选择哪种灭菌剂、浓度大小和灭菌时间的长短一定要有针对性，既要考虑具有良好的灭菌、杀菌作用，同时还要易被蒸馏水洗掉或能自行分解，而且不会损伤或轻微损伤组织材料，且不影响生长，这样才有可能达到预期的灭菌效果。目前常用的灭菌剂如表3-1所示。

选择适宜的灭菌剂处理时，为了使其灭菌效果更为彻底，有时还需要与黏着剂或湿润剂如土温等配合使用，则灭菌效果更好。

2．灭菌方法

由于不同植物及同一植物的不同部位有不同的特点，它们对不同种类、不同浓度的灭菌剂敏感程度不同，因此灭菌方法不尽相同。如果外植体较大而硬，可直接用灭菌剂处理，如果实、叶片、茎段、种子等；如果接种幼嫩的茎尖，一般先取较大的茎尖，表面灭菌后，再在无菌条件下借助解剖镜剥取适宜大小的茎尖培养；如果是细胞，应按培养目的选择合适的起始材料进行灭菌。对于取自植物体内部、有多层包被的微小材料，如花粉、子房、未成熟种子、茎尖等，也可不经灭菌，在无菌条件下剥离后直接接种（具体方法见本项目外植体培养）。但常规的灭菌过程是把经过处理的材料放在自来水下进行冲洗，冲洗的时间因植物而异，一般为30min，然后将材料放到70%的乙醇中约30s，无菌水冲洗，再用0.1%升汞液浸5～10min或2%次氯酸钠溶液浸泡10～15min，无菌水漂洗3～5次。

三、外植体接种

外植体接种是指将灭菌后的外植体在超净工作台上进行分离，切割成所需要的材料大小，并将其转移到培养基上的过程。整个接种过程在无菌条件下。

1．接种室的消毒与灭菌

植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术，做好接种室的消毒是至关重要的。接种室要定期用甲醛和高锰酸钾蒸气熏蒸（或70%乙醇或0.1%新洁尔灭喷雾降尘和消毒）。

2．接种操作

接种前打开接种室和超净台的风机和紫外灯照射20min。接种人员进入接种室前要用肥皂水洗净双手，穿好经灭菌的实验服并戴好口罩，操作前要用70%乙醇擦拭双手和超净工作台台面。接种使用的解剖刀、剪刀、解剖针、镊子、培养皿、三角瓶等要事先经过高压灭菌，操作过程中解剖刀、剪刀、解剖针、镊子要经常在酒精灯上灼烧灭菌，并放凉备用。外植体剥离和切割时，较大的材料可肉眼直接观察切离；较小的外植体需要在解剖镜或显微镜下操作。切取材料通常在无菌条件下的培养皿或载玻片上进行。

接种的具体操作：左手拿试管或三角瓶，将其瓶口靠近酒精灯火焰，瓶口倾斜，以免空气中的微生物落入瓶中，将瓶口外部在火焰上烧数秒钟，然后用右手配合轻轻地取出封口物，再将瓶口放在火焰上，旋转培养瓶口火焰灭菌数秒钟后，用灼烧后冷却的镊子将外植体均匀分布在培养容器内的培养基上，将封口物在火焰上灼烧数秒，封住瓶口，所有材料接种完毕，做好标记，注明接种植物材料的名称，接种日期、处理方法等。

四、外植体培养

培养是指在人工控制的环境条件下，使离体材料生长、脱分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。

（一）培养条件

1．光照

光照对植物组培的影响主要表现在光照时间、光照强度及光质三个方面，它对细胞、组织、器官的生长和分化以及光合作用等均有很大的影响。

一般黑暗条件下利于细胞、愈伤组织的增殖；而器官的分化往往需要一定的光照。光照主要是满足植物形态的建成和花芽的形成和诱导。植物形态的建成一般300～500lx的光照强度基本就可以满足，但对于大多数的植物来说，2000～3000lx比较合适。同时14～16h/d的光照时间就能满足大多数植物生长分化的光周期要求。

光质对愈伤组织诱导、组织细胞的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如杨树愈伤组织的生长表现为红光促进，而蓝光抑制；唐菖蒲子球块接种15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。

一般培养室要求每日光照12～16h，光强1000～5000lx。不同培养物对光照有不同的要求，如荷兰芹器官形成时不需要光照，而对黑穗醋栗来说光可以提高其幼苗的增殖量。如果培养物要求在黑暗条件，可采用铝箔或适宜的黑色材料包裹或置于暗室中培养。

2．温度

温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。大多数植物组织培养的最适温度在23～27℃。但是不同植物组织培养的最适温度不同，如百合的最适温度是20℃，月季是25～27℃。培养室温度一般为25℃±2℃。

3．湿度

组织培养中的湿度主要是指培养室湿度和容器内湿度。培养室湿度一般要求70%～80%的相对湿度，湿度过低则培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。而湿度过高时，易引起棉塞长霉，导致污染。湿度过高用除湿机降湿，湿度过低时可喷水增湿。

容器内湿度主要受培养基的含水量和封口材料的影响。前者又受到琼脂含量的影响。冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基变硬，不利于外植体插入培养基和吸水，导致生长发育受阻。另外，封口材料直接影响容器内湿度情况，封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。

4. pH值

培养基的pH值影响培养物对营养物质的吸收和生长速度。不同植物组织培养对环境的最适pH值的要求是不同的，大多数植物的最适pH值在5.0～6.5，一般培养基pH5.8就能满足绝大多植物培养的需要。pH值过高，不但培养基变硬，阻碍培养物对水分的吸收，而且影响离子的解离释放；pH值过低，则容易导致琼脂水解，培养基不能凝固。

5．培养基的成分

培养基的成分依据培养物、培养方式、培养目的等不同而不同。

6．通气

外植体的呼吸需要氧气，同时培养瓶内的气体成分、培养物本身产生的二氧化碳、乙醇、乙醛等气体会影响培养物的生长和发育，因此一般培养容器采用棉塞、铝箔、专用盖等封口物封口。在液体培养基中，振荡培养是解决通气的良好办法。在固体培养基中，最好采用通气性好的瓶盖或瓶塞。

（二）初代培养

初代培养是指在组培过程中，最初建立的外植体无菌培养阶段，即无菌接种完成后，外植体在适宜的光照、温度、气体等条件下被诱导成茎梢、不定芽或丛生芽、胚状体或原球茎的过程，因此也称为诱导培养。由于外植体的来源复杂，又携带较多杂菌，因此初代培养一般比较困难。

1．外植体的成苗途径

植株再生途径一般分为无菌短枝型、器官发生型、丛生芽增殖型、胚状体发生型、原球茎发生型五种类型，形成的植株称为再生植株。

（1）无菌短枝型　将顶芽、侧芽或带有芽的茎切段接种到培养基上，进行伸长培养，逐渐形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。继代培养时将丛生芽苗反复切段转接，从而迅速获得较多嫩茎（在特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛），也称作“微型扦插”或“无菌短枝扦插”。将一部分嫩茎切段转移到生根培养基上，即可形成完整的植株。这种方法主要适用于顶端优势明显或枝条生长迅速，或对组培苗质量要求较高的一些木本植物和少数草本植物，如月季、矮牵牛、菊花、香石竹等。由于不经过愈伤组织诱导阶段，是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。

（2）器官发生型　外植体经诱导脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织细胞分化形成不定芽（丛生芽），这种途径又称为愈伤组织再生途径。愈伤组织再生途径又可分为以下四种：愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成，即无芽的根或无根的芽；先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，大多植物为这种情况；先产生根，再从根的基部分化出芽形成小植株，这在单子叶植物中很少出现，而在双子叶植物中较为普遍；先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株，类似根芽的天然嫁接，但这种情况少见，而且一定在芽与根的维管束是相通的情况下，才能得到成活植株。

① 愈伤组织的诱导与分化

a．愈伤组织的诱导　在进行愈伤组织培养中，应根据不同的培养目的，获取不同的外植体。如果仅为获得愈伤组织，可取植株茎的切段、叶、根、花和种子，或把其中的某些组织切成片或块状，接种到培养基上即可；如果要做细致的研究，则要考虑外植体的一致性，包括植物材料的来源产地、外植体的大小和形状、生理部位等。在进行这类研究中，常常选用组织块较大的材料，如胡萝卜的贮藏根、马铃薯的块茎等。具体操作中，可用打孔器从经消毒后的块茎和块根中钻出一批圆柱形的组织（取自同一类薄壁组织），然后将其切成相同厚度的小圆片。对经过消毒处理的材料，还应该对其细心修整，除去所有坏死的组织，将材料切成5mm的圆柱形或方形小块，直接放置在培养基上。

植物的组织培养即利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原已分化并具有一定功能的细胞脱离原发育轨道，失去原有状态和功能，而恢复到未分化的愈伤组织状态，这就是植物组织培养中的去分化或脱分化过程。一般双子叶植物比单子叶植物和裸子植物诱导愈伤组织容易，幼年细胞和组织比成年细胞和组织容易，二倍体细胞比单倍体细胞容易。另外，蕨类和藓类植物也有可诱导愈伤组织的报道。

外源激素是植物愈伤组织诱导过程中不可缺少的组成成分。虽然有些组织在只有无机盐和糖的条件下也能形成愈伤组织（如未成熟的柠檬果实、离体的维管束形成层、胡萝卜组织、黑雾组织及多数瘤组织等），但这毕竟是少数。通常情况下，诱导愈伤组织的培养基中都含有植物激素（如IAA、NAA、2，4-D、BA等），而且有些植物在对激素种类的要求上表现出了严格的选择性。另外，有些天然提取物对愈伤组织的诱导和维持十分有益，常用的有椰子汁浓度10%（体积分数），0.5%的酵母提取物，5%～10%的番茄汁。

b．愈伤组织细胞的分化　组织培养中的愈伤组织是指从外植体的内部或切口表面形成的一团没有分化的组织，这种组织具有再分化的能力。愈伤组织在一定的培养条件下又可以经过胚胎发生形成双极性的胚状体，或经过器官发生形成单极性的芽或根，进而重新形成完整的植株，这后一段过程一般称为再分化。

从单个细胞或外植体上形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和分化期。

启动期：启动期又称诱导期，指细胞准备进行分裂的时期。该时期细胞的大小虽然变化不大，但细胞的内部却发生了生理生化变化，如合成代谢加强，蛋白质和核酸的合成等。

分裂期：分裂期指细胞通过一分为二的方式，不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始细胞分裂，使细胞脱分化。处于分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快、结构疏松、缺少组织结构、颜色浅而透明。

分化期：植物愈伤组织形成后，若将它转入分化培养基中，则进入分化瓦解期。分化期是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列的形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。

② 愈伤组织的继代培养

a．培养条件　培养基是按配方组成的底物、矿物质、生长素和维生素的组合，作用于植物的组织培养，是决定植物组织培养成功与否的关键因素。常用的培养基主要有MS、N₆等。培养基中最重要的大量元素为氮素，主要包括铵态氮、硝态氮，但浓度不能过高，通常认为铵态氮高于8mmol/L时，就容易对植物造成伤害。除氮素外还要提供磷、钾等大量元素；微量元素中铁的用量较大，一般用螯合铁，防止pH过高时产生沉淀。植物生长物质能对植物产生显著的影响，其中生长素常用IAA、NAA、IBA、2，4-D，浓度一般为0.1～10mg/L，主要生理功能是诱导根的分化。一般NAA生根比IBA和IAA效果好，但用IAA和IBA生根比较健壮。而NAA生根较细。常用的细胞分裂素是BA、KT、ZT，使用浓度一般0.1～10mg/L，主要的作用是促进芽的分化。

在培养基中加入适当的糖、硫胺素、烟酸、吡哆醇、肌醇、甘氨酸、水解酪蛋白、水解乳蛋白可以满足愈伤组织的生长和分化。糖提供给外植体能量，而且还能维持一定的渗透压。不同种类和浓度的糖，对组织培养的增殖及以后的器官分化均有明显影响。常用的有果糖、葡萄糖、蔗糖等，用量通常为20～70g/L。培养基的形式、渗透压等方面对外植体形态的发生有明显的作用。

培养基中的渗透压，对细胞增殖和体细胞胚的形成都有十分明显的影响，尤其在花药培养中受到重视。培养基的pH值应调整到5.6～6.0的范围，过高或过低均会对组织培养有不利影响。

在组织培养中光对器官的作用是一种诱导反应，而不是提供光合作用的能源。除某些植物组织培养要求在黑暗中生长外，一般均需一定的光照条件，满足苗的形成、根的发生、芽分化和体细胞胚形成等分化和形态建成需要。

在植物组织培养中，温度一般采用24～28℃的恒温条件进行，对一般植物都可较好地形成芽和根。而有些植物则需要在一定昼夜温差下培养。如菊芋在白天28℃和夜间15℃的条件下，对根的形成最好。

b．继代培养物的分化潜力　继代培养物的分化潜力，主要受生理因素和遗传因素的影响。

（a）生理因素　在组织培养过程中，逐渐消耗了母体中原有与器官形成有关的特殊物质，而导致继代培养物分化潜力的变化。如胡萝卜组织培养，初代培养中加入6～10mol/L IAA，才能达到最大生长量，但经多次继代培养后，在不加IAA的培养基上也可达到同样生长量，一般约在继代培养10代以上。这说明植物材料内部发生了一些生理、生化变化。

不同植物保持分化潜力的时间不同，且差异大。近年来研究还表明，即使原来培养过程中丧失分化能力的一些组织，加入腺嘌呤、酪蛋白或酵母汁等物质后，器官分化能力可恢复到一定水平。

（b）遗传因素　在继代培养中通常出现染色体紊乱。尤其是器官发生型，继代培养中分化能力丧失与遗传不稳定有关。所以，在进行继代培养时，要尽量利用芽增殖或苗的途径，而诱导不定芽发生或胚的发生途径，则有一定危险性。

（3）丛生芽增殖型　茎尖、带有腋芽的茎段或初代培养的芽，在适宜的培养基上诱导，可使芽不断萌发、生长，形成丛生芽。将丛生芽分割成单芽增殖培养成新的丛生芽，如此重复芽生芽的过程，称为丛生芽增殖型。将长势强的单个嫩枝进行生根培养，进而形成再生植株。

（4）胚状体发生型　胚状体发生型是再生植株通过与合子胚相似的胚胎发生过程，形成类似胚胎的结构，最终发育成小苗，但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面或游离的单细胞，也可从外植体表面已分化的细胞产生。

（5）原球茎发生型　原球茎是一种类胚组织，可以看作呈珠粒状短缩的、由胚性细胞组成的类似嫩茎的器官。一些兰科植物的茎尖或侧芽培养可直接诱导产生原球茎，继而分化成植株，也可以通过原球茎切割或针刺损伤手段进行增殖培养。

各种再生类型的特点比较见表3-2。

2．根的培养

离体根的组织培养具有重要的理论和实践意义。首先是进行根系生理和代谢研究最优良的实验体系。因为根系生长快，代谢强，变异小，加上立体培养时不受微生物的干扰，可以通过改变培养基的成分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化规律；二是建立快速生长的无性系就可进行其他的实验研究，进行药物、微量活性物质及一系列次生代谢产物的工厂化生产；三是通过根细胞的培养可再生植株，用于生产实践，也可诱导突变体，应用于育种中。

（1）材料来源与消毒　根的培养材料一般来自无菌种子发芽产生的幼根或植株根系经消毒处理后的切段。

（2）离体根的培养方法　离体根的培养首先要建立起获得大量无性系的方法。将种子消毒后在无菌条件下萌发，根伸长后从根尖一端切取长10～12mm的根尖并接种于培养基中，这些根的培养物每天大约生长10mm，4天后发育出侧根，待侧根生长约1周后，即切取侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长并长出侧根，又可切下进行培养，如此反复切接就可得到从单个根尖衍生的无性繁殖系。

离体根培养一般应用100mL的三角瓶，内装40～50mL培养液，如果对离体根进行长时间的培养，就要采用大型器皿，例如可用盛有500～1000mL培养液的发酵瓶。根据需要可在瓶中添加新鲜培养液继续培养或将根进行分割转移后继代培养，为避免培养过程中培养基成分变化对生长的影响，可采用流动培养的方法。

（3）离体根培养的培养基　离体根培养所用的培养基多为无机盐离子浓度低的White培养基。若使用无机盐离子浓度高的MS、B₅时，必须将其浓度稀释为原浓度的2/3或1/2。

（4）影响离体根生长的因素

① 基因型　不同植物对培养的反应不同。如番茄、马铃薯、烟草等植物的离体根能快速生长并产生大量健壮的侧根，可进行继代培养而无限生长；有些植物如萝卜、向日葵的根能较长时间的培养，但不能无限培养，久之失去生长能力。一般情况下，木本植物的离体根培养难于草本植物；处于旺盛生长期的根系和根尖易于培养。这说明不同的植物类型，需要提供相应的培养条件，而且即使在同一生长条件下，由于营养、代谢和基因型的差异也会表现出生长特性上的差异。

② 营养条件　离体根的生长要求培养基含有全部的必需元素。它能够利用单一的硝态氮或铵态氮。在适宜的pH条件下，硝酸盐的效果较为良好。硝态氮、钙、硼和铁利于根的发生。而缺少微量元素就会在培养过程中出现各种缺素症，如缺铁会导致根细胞停止分裂，无法实现增殖，并破坏根系的正常活动；缺硼会降低根尖细胞的分裂速度，阻碍细胞伸长。培养基中添加维生素B₁和维生素B₆最重要，缺少则根的生长受阻，一般使用浓度为0.1～1.0mg/L。糖是培养基必不可少的附加物，一般以蔗糖为最好，使用浓度应稍低，如玫瑰生根的蔗糖浓度为2%。但在禾本科植物离体根的培养中，葡萄糖的效果则较好。维生素类物质中，最常用的为硫胺素（维生素B₁）和吡哆醇（维生素B₆）。

③ 生长物质　在各类植物激素中，以生长素研究得较多。从离体根培养对生长素的反应，可以表现为：a.生长素抑制离体根的生长，如樱桃、番茄、红花槭；b.生长素促进根的生长，如欧洲赤松、白羽扁豆、玉米、小麦；c.离体根的生长有赖于生长素，如黑麦、小麦的一些变种。赤霉素能明显影响侧根的发生与生长，加速根分生组织的老化；激动素则能延长单个培养根分生组织的活性，有抗“老化”的作用。

激素对根生长的影响是一个综合过程，如激动素在低浓度蔗糖（1.5%）的条件下对番茄离体根的生长有抑制作用，但是在高浓度蔗糖（3%）的条件下激动素能够促进根的生长。赤霉素和萘乙酸在蔗糖浓度较低时能够增加番茄离体根的侧根数量，将吲哚乙酸处理过的番茄根转移到无吲哚乙酸的培养基中，吲哚乙酸对番茄根生长的抑制作用将会消失。另外，激动素能与赤霉素和萘乙酸的反应相拮抗。因此，选准激素并与其他培养条件相配合，是保证离体根培养成功的重要方面。

④ pH　植物组织培养适宜的pH范围随培养材料和培养基的组成而发生变化，一般为5.0～6.0。如在番茄根的培养中，用单一硝态氮作为氮源时，培养基的pH值应为5.2；用单一铵态氮源时，pH7.2为最好。水稻根的培养在pH值为3.3～5.8的范围内随pH值的升高而加速；此外，当pH值升高（pH值为5.8～6.2）时铁会发生沉淀，造成培养基中缺铁。

⑤ 光照和温度　离体根培养的温度一般以25～27℃为最佳，要求在遮光条件下培养。

3．普通茎尖培养

茎尖是植物组织培养常用的外植体。这是因为茎尖不仅生长速度快、繁殖率高，不易产生遗传变异，而且是获得脱病毒苗木的有效途径。茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。茎尖分生组织培养主要是指对茎尖长度不超过0.1mm，最小只有几十微米的茎尖进行培养，这种培养可获得无病毒植株。但这样小的茎尖分离实际上是很困难的，而且成苗时间也很长，需要一年乃至更长的时间。因此在茎尖分生组织培养中往往采用带有1～2个叶原基，长度不超过0.5mm的生长锥进行培养，称微茎尖培养。普通茎尖培养是指对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养，这类茎尖的培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需要的时间短，能加快繁殖速度。

通过茎尖培养进行植物的快速无性繁殖在一些植物中已经成为一门成熟的技术而被广泛应用。由于这一技术是在无菌条件下，且又是在一个非常小的范围内来进行大量繁殖的，因而人们又把这种繁殖技术称之为微繁技术。

（1）取材与消毒　从健壮、生长旺盛、无病的供试植株的茎、藤或匍匐枝上切取1～2cm的嫩梢。木本植物可在取材前对嫩梢喷几次灭菌药剂，以保证材料不带或少带杂菌。将采到的材料去掉肉眼可见的叶片，在流水下冲洗干净，然后将材料放到75%的乙醇中约30s，无菌水冲洗，再用0.1%升汞（HgCl₂）液浸5～10min或20倍的次氯酸钠溶液浸泡8～10min，也可以在用75%乙醇消毒后，用两种消毒剂连续消毒，消毒剂溶液中可加一两滴吐温-20。无菌水漂洗3～5次。嫩茎的顶芽消毒时间宜短，而来自较老枝条上的顶梢和侧芽及有芽鳞片包被的芽消毒时间应适当延长。

（2）接种　消毒后在无菌条件下进行剥离，一般用于快繁的茎尖组织要大，为0.3～0.5cm，可带2～4个叶原基或更多（图3-1）。有些植物的茎尖培养过程中由于多酚氧化酶的氧化作用而发生褐化，使培养基变褐，影响材料的成活。所以在接种时，不能用生锈的解剖刀，动作要敏捷，随切随接，减少伤口在空气中暴露的时间；也可将切下的茎尖材料在1%～5%的抗坏血酸液中浸蘸一下再接种，一般每瓶接种1个茎尖。除茎尖组织外，一些植物的茎切段和一些鳞茎植物的鳞茎切块、块茎、球茎等还可以通过培养产生不定芽而进行繁殖。

（3）培养条件

① 培养基　目前用于快速繁殖的基本培养基很多。常用的有MS培养基、B₅培养基。MS适合大多数双子叶植物，B₅适用于许多单子叶植物，木本植物的茎尖培养可选用WPM培养基。培养基中的碳源一般为蔗糖，浓度为2%～3%。固化剂选用琼脂。而对于茎尖容易发生褐化的可以考虑采用液体培养基并及时将培养物从褐化的培养基中转移到新鲜的培养基中去。培养基的pH值影响茎尖对营养液的吸收和生长速度，对大多数植物的茎尖培养来说，pH值应控制在5.6～5.8。

天然有机物椰子汁有利于兰花的增殖，麦芽汁有利于柑橘属的分化，水解乳蛋白或水解酪蛋白则有助于许多植物不定芽和不定胚的分化。培养基中生长素与细胞分裂素的比例影响器官发生的方向。为了使茎尖在培养中顺利地发育成健壮完整的植株，重要的是调节生长激素的水平。

茎尖的初代培养属于无菌短枝发生型。外植体启动生长的关键主要是培养基的激素配比与浓度，一般应使用较高浓度的细胞分裂素和较低浓度的生长素，能够解除顶端优势的抑制作用，诱导产生丛生芽。生长素浓度过高容易产生愈伤组织；激素配比适当，则茎尖向上生长成无根苗。在利用茎尖微繁殖进行快速繁殖时，一般使用三种类型的生长调节剂：一种是生长素，用得最多的是NAA，其次是IAA，浓度一般在0.1～1mg/L；第二类是细胞分裂素，常用6-BA、KT和玉米素，细胞分裂素在促进不定芽产生上效果显著，使用浓度在0.1～10mg/L，一般使用0.5～2mg/L；第三类是赤霉素、它往往有利于茎尖的伸长和成活，需要的浓度较低，一般为0.1mg/L，浓度太高会产生不利影响。

② 光照　光照度在1000～3000lx，光周期实行连续16h光照、8h黑暗，有利于茎尖培养和芽的分化与增殖。增强光照有利于试管苗生根，且对于试管苗移栽有良好的作用，但强光直接照射根部，会抑制根的生长。所以，在生根培养时最好在培养基中加0.1%～0.3%活性炭，以促进生根。

③ 温度　常用的培养温度在25℃左右。但因植物种类和培养过程的不同，有时也采用较低或较高的温度，或给予适当的昼夜温差等处理。

④ 湿度　由于生长点培养时间较长，琼脂培养基易于干燥，这可以通过定期转移和包口封严等方法加以解决。在干燥季节还要注意室内湿度管理，以防培养基内的水分散失过多而对培养不利。

一般顶芽和腋芽培养30～40d可长成新梢。兰科植物会在茎尖基部诱导产生原球茎，1个月左右茎尖长成新梢，就可进行增殖培养。有时也可边继代增殖边诱导生根。其方法是取比较长的新梢（如2cm以上）转入生根培养基，余下较短的新梢继续继代培养。兰科植物切割原球茎进行继代增殖。中间繁殖体增殖到一定数量后，就要将增殖的嫩枝进行壮苗和生根，产生完整植株，以便移植。茎尖培养快繁程序见图3-2。

（4）影响茎尖培养的因素

① 基因型　茎尖培养与其他组织培养一样，受基因型的影响很大，不同科、属植物要求的条件有很大差别，甚至同一属的不同种间以及品种间，其表现也不一样。

② 外植体的大小　培养茎尖材料过大，不利于丛生芽与不定芽的形成。外植体越大也越容易污染。但外植体也不要太小，非常小的存活率很低。

③ 供试植株的生理状态　一般春天植物开始生长，芽已经膨大，但芽鳞片还没有张开时，最为合适。对于某些需要高温和低温处理或特殊光周期处理才可以打破休眠的块茎、鳞茎、球茎，常常要处理以后才能剥取茎尖进行培养。

④ 芽在植株上的部位　对于草本植物使用顶芽或上部的芽作分生组织，常常比用侧芽或基部的芽容易。

⑤ 供试植株的年龄　多年生木本植物使用部分年幼、阶段年龄较低的根蘖苗或不定芽作材料，或采取某些措施如将芽嫁接在实生苗上、修剪、进行营养繁殖。一年或多年生草本一般采用营养生长早期的顶芽、腋芽。

⑥ 培养基　不同植物对培养基的要求不同，培养时要进行筛选。

⑦ 褐变　见本项目后文的“组培的常见问题及预防措施”。

⑧ 玻璃化　见本项目后文的“组培的常见问题及预防措施”。

⑨ 极性　极性现象有着广泛的作用与影响。这是由于在植物中某些化学物质存在梯度，如生长素的传导梯度作用等。

⑩ 后生变化　离体培养形成的小植株，可能在移植到外界后，将在培养时的影响继续带到以后的生长中去，如形成的第一批叶子在形态上是不正常的，或过早地衰老。因此，在移栽时要选择好培养基，并控制好移栽到栽培混合物上的时间，可以避免这种现象。

⑪ 中间繁殖体的形态发生能力　茎尖微繁殖技术的一个重要环节就是中间繁殖体稳定的形态发生能力，是微繁殖成功与否的关键。研究证明：大多数以顶芽或不定芽增生方式繁殖的植物中，在培养增殖许多代之后，仍然保持着旺盛的增殖能力。对于这种繁殖类型，似乎不大会出现形态发生能力减弱或丧失的问题，它们完全类似于常规的无性繁殖。用不定芽进行增殖，要掌握好分割丛生芽的最佳时期。

⑫ 遗传稳定性　茎尖微繁殖主要是为了获得在遗传上完全一致的、稳定的无性系群体。仔细地选择培养材料、控制好培养条件、防止变异对微繁殖来说是非常重要的。

4．茎段培养

（1）外植体选择　取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，如果是木本植物则取当年生嫩枝或一年生枝条，去掉叶片，剪成3～4cm的小段。

（2）外植体消毒　材料消毒的一般程序同普通茎尖培养。如果材料表面有绒毛应在消毒剂中滴加1～2滴吐温-20或吐温-80，后用无菌水冲洗数次。注意根据材料的老嫩和蜡质来确定消毒时间。

（3）接种　将消毒好的茎段去除两端被消毒剂杀伤的部位，分切成单芽小段竖插于诱导培养基中。其他接种要求同普通茎尖培养。

（4）培养基与培养条件　同普通茎尖培养。

（5）培养　茎段接种后不久，在切口处特别是基部切口处有时会形成少量愈伤组织，但主要是腋芽开始向上伸长生长，形成新茎梢，有时会出现丛生芽（图3-3）。产生的丛生芽可进行增殖培养、生根培养。

5．叶的培养

离体叶培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养。由于叶片是植物进行光合作用的器官，又是某些植物的繁殖器官，因此离体叶培养在植物器官培养中占有重要地位。

离体叶培养具有重要的理论和实践意义。首先，它是研究叶形态建成，光合作用，叶绿素形成等理论问题的良好方法。离体叶不受整体植株的影响，这样就可以根据研究的需要，通过改变其培养基成分来研究其营养的吸收、生长和代谢变化。第二，通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实叶细胞的全能性。第三，通过离体叶组织、细胞的培养，探索离体叶组织、细胞培养的条件和影响因素，为叶片原生质体培养和原生质体融合研究提供理论依据。第四，利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系数。第五，叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体而应用于育种实践。

（1）叶原基培养　叶原基培养是研究叶形态建成的重要手段。具体方法如下：采用休眠期的顶芽，剥去一部分鳞片后，在5%次氯酸溶液中浸泡20min，进行表面消毒。 切取柱状叶原基进行培养。培养基采用Knop’s无机盐（部分修改）或Kullosorl（1951）配方，添加Nitsch配方中的微量元素，再加CoCl₂ 25mg/L和2%蔗糖、8%琼脂，pH值调至5.5，部分实验中添加维生素、水解酪蛋白等。温度为24℃，人工光照24h。

（2）幼叶片培养

① 材料的选择与消毒　用植物幼嫩叶片进行培养时，首先选取植株顶端未充分展开的幼嫩叶片。经流水冲洗后，用蘸有少量75%乙醇的纱布擦拭叶片表面后，放入1%升汞溶液中消毒5～8min，再用无菌水冲洗3～4次。消毒时间根据供试材料的情况而定，特别幼嫩的叶片时间宜短。

② 接种　消毒后的叶片转入到铺有滤纸的无菌培养皿内。用解剖刀切成5mm×5mm左右的小块，然后上表皮朝上接种在固体培养基上培养。

③ 培养

a．培养基　常用的培养基有MS、White、N₆、B₅等。培养基中的糖源一般都使用蔗糖，浓度为3%左右。培养基中附加椰子汁等有机添加物，有利于叶片组织培养中的形态发生。激素是影响烟草叶组织脱分化和再分化的主要因素。

对大多数双子叶植物的叶组织培养来讲，细胞分裂素，特别是KT和6-BA有利于芽的形成；而生长素，特别是NAA则抑制芽的形成而有利于根的发生。2，4-D是一种强生长剂，有利于愈伤组织的形成。

b．培养条件　叶片组织接种后于25～28℃条件下培养，每天光照12～14h，光照度约为1500～2000lx。不定芽分化和生长期应增加光照度到3000～10000lx。

c．离体叶组织的茎和芽发生途径　在离体叶组织脱分化和再分化培养中，茎和芽的分化主要有以下三个途径。

一是直接产生不定芽。即叶片组织离体培养后，由离体叶片切口处组织迅速愈合并产生瘤状突起，进而产生大量不定芽，或由离体叶片表皮下栅栏组织直接脱分化，形成分生细胞进而分裂形成分生细胞团，产生不定芽。在这两种情况中，一般都不形成愈伤组织，是离体叶片直接产生不定芽的形式。

二是由愈伤组织产生不定芽。叶组织离体培养之后，首先由离体叶片组织脱分化形成愈伤组织，然后由愈伤组织分化出不定芽；或者脱分化形成的愈伤组织经继代培养后诱导不定芽的分化。这类方式的不定芽产生，可以两种方式诱导形成。一种是一次诱导，即利用一种培养基，在适当激素调节下，先诱导产生大量愈伤组织，愈伤组织进一步分化出不定芽。第二种是两次诱导法，即先利用脱分化培养基诱导出愈伤组织，后利用再分化培养基诱导出不定芽。

三是胚状体形成。大量的研究证明，叶片组织离体培养中胚状体的形成也是很普遍的。在菊花叶片培养中，一般由愈伤组织产生胚状体居多，这类胚胎体系由愈伤组织中的分生细胞先经过分裂形成胚性细胞团，胚性细胞团再进一步发育成原胚、球形胚到鱼雷形胚。其次，叶片组织如栅栏细胞、表皮细胞和海绵细胞经脱分化后都能产生胚状体。烟草、番茄、山楂等植物的叶片组织都有分化成胚状体的能力。张丕方等（1985）通过非洲紫罗兰的叶片诱导胚状体，用于快速繁殖种苗。

其他途径如大蒜的贮藏叶及水仙的鳞片叶经离体培养后，直接或经愈伤组织再生出球状体或小鳞茎而再发育成小植株。兰科植物的叶尖培养中也可经原球茎形成。

（3）影响叶组织培养的因素

a．基因型　不同种类的植物在叶组织培养特性上有一定的差异，同一物种不同品种间叶组织培养特性也不尽相同。

b．细胞分裂素　两种细胞分裂素对芽的分化影响，6-BA的作用好于KT的作用，但6-BA对不定芽的进一步发育即茎叶的形成有抑制作用。

c．细胞分裂素与生长素的组合　离体叶的培养较茎尖、茎段培养难度大，常常需要多种激素的配合使用，并且不同培养阶段需要更换不同的激素组合。如杏离体叶培养使用 1/2MS培养基，ZT与2，4-D的组合可诱导其愈伤组织的产生，KT与NAA的组合可从愈伤组织中诱导不定芽的产生；烟草叶培养中在附加6-BA 2mg/L、6-BA 2mg/L＋NAA 0.02mg/L、6-BA 2mg/L＋NAA 0.1mg/L培养基中形成大量的芽。

d．供试植株的发育时间和叶龄　研究表明，烟草成株期叶组织脱分化和再分化需要的时间较长，而且叶片膨大体积较大，多在刀口处形成大量的愈伤组织和分生细胞团，芽苗大多发生在这些细胞分生团和结构致密的愈伤组织上，不像幼叶那样直接从不同部位成苗。个体发育早期的幼嫩叶片较成熟期幼嫩叶片分化能力高。

离体叶片本身的位置对叶片组织的分化也影响很大。同一株烟草不同叶位叶片对器官分化的影响不同，发育完全的叶片，叶组织器官分化能力较发育幼龄叶片组织再分化能力低得多。

e．叶脉　在离体叶片再生中，叶脉的作用也是明显的。不少植物的叶外植体常从叶柄和叶脉的切口处（如杨树、中华猕猴桃等）形成愈伤组织和分化成苗。

f．极性　极性也是影响某些植物叶组织培养的一个重要因素。烟草一些品种离体叶片若将背叶面朝上放置时，就不生长、死亡或只形成愈伤组织而没有器官的分化。

g．损伤　为了诱导愈伤组织而对离体叶片进行的损伤操作对于愈伤组织的形成具有一定的影响。大量的叶片组织培养证明，大多数植物愈伤组织首先在切口处形成，或切口处直接产生芽苗的分化。对于损伤反应的机制不少人提出过看法。可以设想，损伤作为一种刺激，一方面是造成伤口处部分细胞的破损，细胞内某些物质流出产生的影响；另一方面，损伤造成了组织系统的分割，使整个外植体更趋于呈开放系统状态，伤口附近的未破损细胞，也不可避免地受到一定的应力形变和细胞内生化代谢的改变，而这种变化，对细胞分化具有很大影响。但是，损伤引起的细胞分裂活动并非诱导愈伤组织和器官发生的唯一源泉。一些植物（如某些菊花、秋海棠）的愈伤组织还可以从没有损伤的离体叶组织表面大量发生。

6．胚胎培养

胚胎培养是指将植物的胚胎与母体分离在已知的培养基上培养的过程。胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养和子房培养。

（1）胚培养　胚培养是指采用人工方法将植物胚从植株的种子、子房、胚珠中分离出来在无菌条件下使其生长发育形成幼苗的过程。从植物母体上取出的胚称为离体胚，离体胚的培养分为幼胚（指子叶形成以前）培养和成熟胚培养两种类型。

① 幼胚培养　幼胚培养是指未发育成熟的胚培养，它要求较好的培养条件和较复杂的操作技术。

a．表面消毒　取大田或温室里种植的杂交植株的授粉后的子房，用70%乙醇进行几秒钟的表面消毒，接着用饱和漂白粉或0.1%升汞浸泡10～30min，再用无菌水冲洗3～4次。

b．胚的剥离　在高倍解剖镜下进行解剖，用刀片沿子房纵轴切开子房壁，再用镊子夹出胚珠，剥去珠被，取出完整的幼胚。在剥离过程中幼胚极易失水干缩，因此在剥离时一定要注意保湿，且操作要快。

c．接种培养　剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上，放在培养室中进行培养。培养室温度20～30℃，光照强度2000lx，每天光照10～14h。

d．幼胚离体培养的生长发育方式　幼胚培养中，常见的有下列3种生长方式。

（a）胚性发育　幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，通过这种途径发育的幼胚一般情况下一个幼胚形成一个植株。

（b）早熟萌发　未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫早熟萌发。幼胚接种后，离体胚不进行胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚发育成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象叫丛生胚现象。

（c）愈伤组织　在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。

② 成熟胚培养

a．取材与消毒　将成熟饱满的种子在蒸馏水中浸泡一段时间，用70%的酒精浸泡消毒10s，然后用10%的次氯酸钠灭菌20min，经无菌水冲洗3次后备用。

b．种胚剥离培养　将一粒种子放在无菌培养皿中，用镊子夹住，用解剖刀先将种皮划破，再用另一把镊子轻轻把种皮剥去，用解剖刀沿胚胎的边缘小心剥离胚乳。分离出胚后移入装有培养基的三角瓶中，将接有胚的三角瓶放入黑暗中培养，保持温度25℃。培养3～4d后，转入光照下培养，观察其生长状况。

③ 胚培养条件

a．培养基　成熟胚是一个发育成熟的两极结构，因此对培养条件的要求一般不是很高，在含有基本培养基成分的培养基中即可生长，而幼胚与成熟胚相比较，幼胚则完全是异养的，对培养基要求高，除需提供大量和微量无机盐混合物外，还需提供维生素类和植物激素。胚龄越小要求的培养基的成分就越复杂。

用于培养成熟胚的培养基主要是Tukey、Randolph、White培养基。在培养基中以大量元素和微量元素的无机盐为基本成分，此外还加入一定浓度的糖类物质和多种生长辅助物质。

适宜幼胚培养的培养基主要有Cox、Rijven、White、Rangaswany、Norstog等幼胚培养基以及植物组织培养常用的White、MS、B₅和Nitsch培养基。幼胚培养基中添加的蔗糖、维生素和氨基酸等在胚培养中起着较为重要的作用。

b．蔗糖　蔗糖在培养基中起着提供碳源和调节培养基的渗透压的作用。对于幼胚及脱离胚乳或与子叶分离后的成熟胚来说都是必需的。因为它们本身缺少贮藏物质，而且不能进行光合作用。一般来讲，培养基中加入的糖以蔗糖最为适宜，除蔗糖外，也有使用葡萄糖、果糖及甘露醇等作碳源的。蔗糖使用的浓度与幼胚所处的发育阶段有关，幼胚所处的发育阶段越早，所要求的蔗糖浓度越高，如球形胚一般要求蔗糖浓度为8%～12%，而心形胚则只要求蔗糖浓度为4%～6%。

c．生长辅助物质及培养条件

（a）维生素类　如盐酸硫胺素（维生素B₁）、盐酸吡哆醇（维生素B₆）、烟酸（维生素B₃）、肌醇、泛酸钙、抗坏血酸（维生素C）、生物素等。维生素对培养发育初期的胚来说，一般认为是必需的。维生素及其衍生物对胚生长的促进作用不同，例如盐酸硫胺素对几种植物胚的培养表现出促进根的伸长，而生物素、泛酸钙和烟酸对茎生长的促进作用比对根更为显著。

（b）氨基酸　对胚培养比较重要的氨基酸和酰胺有甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，在培养基中添加不同氨基酸，对胚的生长是非常有效的，几种不同的氨基酸以适当配比加入，往往可获得较好的效果。

（c）植物生长物质　植物生长物质对根原基和茎原基的生长和形态分化有明显的影响。这些植物生长物质包括生长素类、赤霉素类和细胞激动素类等。低浓度的GA₃和KT能促使幼胚早熟萌发， IAA和ABA具有抑制早熟萌发和促进胚正常发育的作用，但其使用浓度应严格控制，一般以低浓度为宜，且因不同的植物而有所变化。此外，生长素与其他激素的比例有时也会严重影响胚的发育方式，生长素比例高时一般容易形成愈伤组织。

（d）天然有机物　进行幼胚培养时，在培养基中加入适宜的天然产物有机物，如酵母提取物、水解酪蛋白（含有19种氨基酸）、椰乳、麦芽提取物以及胚乳提取物等，能有效地促进幼胚的离体生长发育。例如，椰乳有促进幼胚生长和分化的作用，但只能通过过滤的方法进行消毒。

（e）pH值　一般培养基的pH值在5.2～6.3。但植物不同，胚生长的最适pH值不同，如荠菜胚培养要求pH值为5.4～7.5，大麦胚培养要求pH值为4.9，番茄胚培养要求pH值为6.5，水稻胚培养pH值为5.0。且胚发育的阶段不同，培养基的pH值也不同。如曼陀罗的幼胚培养中，心形胚要求pH值为7.0左右，而随着胚的长大其最适pH值变化为5.5。在萝卜胚培养时，幼胚要求pH值为6.8，而成熟胚则要求pH值为5.5。所以，随着幼胚体积的增大其所需培养基pH值由高到低，从中性向酸性发展。

（f）温度　对于大多数植物胚的培养，温度控制在25℃是适宜的，但有些则需要较低或较高的温度。例如，禾本科植物成熟胚的萌发温度范围在15～18℃，马铃薯在20℃较好，柑橘、苹果和梨在25～30℃是合适的。有一些植物的胚培养需要在变温条件下进行。如桃胚的培养中，必须将接种在培养基上的胚放在2～5℃低温下处理60～70d，然后转入白天24～26℃、夜间16～18℃的变温条件下培养，桃胚才能萌发。

（g）光照　通常胚培养是在弱光下进行的。幼胚的培养在黑暗或弱光条件下均可，达到萌发时则需要光照。一般认为12h的光照与12h黑暗交替的条件对胚芽的生长有利，但对胚根的生长不利。光照对幼胚发育有轻微抑制作用，离体培养条件下，幼胚正常胚性发育对光的要求还应根据植物种类来决定。如棉花，胚先在黑暗中培养，然后转入光照下培养，子叶的叶绿素生成很慢；而转入弱光下培养的幼胚，子叶很容易产生叶绿素。荠菜幼胚培养时，每天以12h光照比全暗条件好。

（h）液体或固体培养基　根据幼胚和成熟胚相应发育时期胚乳的状态推测，可能液体培养基适合于幼胚培养，而固体培养基适合于成熟胚培养。

④ 胚培养的应用

a．在远缘杂交育种中的应用　在远缘杂交育种时由于胚发育不良，胚乳不能正常发育，胚和胚乳之间形成类似糊粉层的细胞层，阻碍了营养物质从胚乳进入胚，从而造成胚的中途败育，经常得不到有生活力的种子。而利用早期幼胚离体培养，可以克服杂种胚的早期败育，产生远缘杂交种。

b．克服珠心胚的干扰，提高育种效率　在柑橘、杧果、仙人掌等多种植物中，存在一个特殊问题，即多胚现象，除正常的有性胚外，还有许多由珠心组织发育的多个不定胚，不定胚常侵入胚囊，影响合子胚发育，利用杂交幼胚早期离体培养排除珠心胚的干扰，获得杂种胚，大大提高杂交育种的效率。

c．打破休眠、缩短育种周期　许多植物的种子发育不完全或有抑制物质而影响种子的萌发。如银杏的种子脱离母体后，外形好似成熟了，但胚还未发育完全，需要再过4～5个月才能成熟，油棕需要的时间更长，大约需要几年。针对这种现象，可以采用幼胚培养，从而使幼胚提早成熟，种子提早萌发。在大白菜的育种工作中，为了缩短育种周期，在授粉后的适当时期将幼胚取下，进行组织培养，促其提早萌发，尽早成苗。同时在幼苗长成之后，在培养基中进行低温春化处理，解决了常规使用的种子萌发后进行春化处理所造成的幼苗衰弱成活率很低的矛盾。通过胚培养可以使菖蒲由种子萌发至开花的时间由原来的需要2～3年缩短至1年以内。

d．测定休眠种子的萌发率　未经后熟的种子和后熟的种子胚，在离体培养下萌发速率是相同的。因此，应用胚培养技术还可以测定各种休眠种子萌发率的高低。

e．理论研究中的应用　在探讨植物胚发生的过程中，许多重大的理论问题，如胚发生的具体条件，胚乳的作用，胚胎中各种组织对生长物质的反应，胚胎的切割实验等，都可以借助于组织培养的方法去解决。胚培养方法还可以与其他方法（如辐射）相结合。如在辐射育种中，越接近临界剂量，突变率越高，但成活率则变低。而采用临界以上的高剂量照射作物的胚，可提高变异率，但已变异的胚常因过度损伤而在发育中途死亡。在其死亡之前，将胚进行人工培养，就可能成活，从而提高变异频率。

（2）胚乳培养

胚乳培养是指将胚乳从母体上分离出来，在无菌的条件下使其生长发育形成幼苗的过程。

① 取材、消毒

a．具有大块胚乳的种子　可将种子直接做表面灭菌，然后用无菌水冲洗，在无菌条件下除去种子的外皮即可接种。

b．对于胚乳被黏性物质包裹　种子表面灭菌，在无菌条件下除去种子的外皮，去掉黏性物质即可接种。

c．对有果实的种子　取授粉后几天的幼果用70%乙醇处理几秒，用饱和漂白粉灭菌 10～20min，用无菌水冲洗3次，在无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳，接种到培养基上。

② 培养条件

a．培养基　培养基多选用MS、White培养基。

b．胚的影响　胚对于胚乳的培养有一定的影响。如桃、葡萄、枸杞，带胚的产生愈伤组织比不带胚的高，大戟科的成熟胚乳培养初期需要带胚。苹果、柑橘等未成熟的胚乳不带胚也可诱导获得完整植株。

c．植物生长物质　植物生长物质是胚乳培养产生愈伤组织的重要因素。植物不同对植物生长物质的种类和浓度要求不同。如大麦胚乳培养需要加2，4-D，猕猴桃则需要高浓度的玉米素。

d．天然提取物　如20%的番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰乳、酪蛋白水解物和酵母提取物等应用于胚乳培养也取得了较好的效果。

e．蔗糖　蔗糖是胚乳培养的最好碳源。使其浓度在2%～8%。不同胚乳培养要求的蔗糖浓度不同，如小麦为8%，枸杞为5%。

f. pH值　适宜的pH值范围是4.5～6.5。如玉米为pH 6～7，小黑麦为pH 5.6，蓖麻为pH 5.0。

g．光照　不同植物胚乳培养对光照的要求不同，如玉米胚乳培养在黑暗条件下较好，蓖麻胚乳培养则需要1500lx的连续光照。一般植物胚乳培养要求采用10～12h的黑暗和光照交替。

h．温度　温度一般要求在24～26℃。低于20℃或高于30℃均会减弱愈伤组织的生长。　　

③ 愈伤组织的诱导　胚乳外植体接种到培养基上6～10d后，在切口处形成乳白色的突起，不断生成团块。少数胚乳外植体转变为绿色，形成叶丛状。但大多数增生为新的团块，形成典型的愈伤组织，及时转入到分化培养基上，分化出芽来，进行生根培养。

④ 胚乳植株染色体数目的检查　取植株根尖或幼叶或胚乳愈伤组织用0.2%～0.5%的秋水仙碱溶液或对氯苯饱和水溶液在25℃条件下处理4～8h后，再用流水冲洗5～10min。以卡诺溶液或FAA液固定，用1mol的盐酸在60℃水浴下水解8～10min，然后染色、压片、镜检、记数。

胚乳植株镜检的表现如下。

a．稳定型　胚乳培养物在继代培养中染色体数目无变化，分裂行为正常，表现出稳定的器官分化能力，如枣。

b．畸变型　胚乳培养物的细胞染色体出现异常行为，分化器官能力低，染色体数目多为数倍。如苹果绝大多数的细胞为多倍体或非整倍数的，只有少数的为三倍体。

⑤ 胚乳培养的应用

a．获得三倍体。

b．倍性多样可获得各种类型的非整倍体。

c．获得附加系和换代系。

（3）胚珠培养和子房培养

① 胚珠培养　将胚珠从母体上分离下来在无菌的条件下使其生长发育形成植株的过程。包括受精胚珠培养和未受精胚珠培养。

a．胚珠的获取与消毒　培养受精的胚珠应在大田或温室摘取授粉时间合适的子房；如培养未受精的胚珠则应在授粉前适当的时间摘取子房。先用70%的酒精进行表面消毒30s，放入5%的次氯酸钠溶液中10min，再用无菌水冲洗数次。在无菌条件下用解剖刀沿子房纵面切开，取出胚珠接种。

b．胚珠培养　培养基一般采用MS、White、Nitsch等固体培养基。培养的温度为26℃，相对湿度为50%～60%，连续光照或每天光照18h。

c．胚珠的发育　受精的胚珠有两种情况：一种情况是离体胚珠形成种子；另一种情况是胚珠经过脱分化形成愈伤组织，如愈伤组织起源于胚囊细胞则形成的植株为杂合体，若起源于珠被细胞则植株与母本一致。未受精的胚珠能诱导大孢子或卵细胞分化为单倍体。

② 子房的培养　将子房从母株上分离下来，在无菌条件下使其进一步发育成幼苗的过程。包括授粉子房培养和未授粉子房培养。

a．子房的获取与消毒　培养未受精的子房一般在开花前1～5d进行采摘子房；培养受精的子房一般在授粉后数天进行采摘，具体的天数按需而定。

b．接种　消毒后的幼花在无菌条件下用镊子夹出子房接种到培养基上。

c．子房培养　子房培养一般使用MS、N₆、B₅等固体培养基。温度要求26℃，相对湿度为50%～60%，每天光照16h。

d．子房的发育过程

子房存在两种细胞，即性细胞和体细胞。

③ 胚珠和子房培养的应用

同时培养未授粉子房（胚珠），在试管中进行受精可克服花粉与子房间的不亲和性。

7．花药和花粉培养

花药培养是指把发育到一定阶段的花药接种到人工培养上，使其发育和分化成为植株的过程。花粉培养是将花粉粒从花药中分离出来，进行培养进而发育成完整植株的过程。两者的共同点是利用花药染色体数目的单倍性，培育单倍体植株如图3-4所示。

（1）花药培养

① 花药的发育时期　大多数植物的适宜花药发育时期是花粉单核期，特别是单核中晚期。因此培养前要进行花粉发育时期的检测：利用乙酸洋红染色剂染色进行镜检，像水稻不易被乙酸洋红染色的可采用碘-碘化钾染色。此外可将压片染色与材料外部形态结合到一起，确定处于花粉发育适宜期的花器官相关形态特征，供田间采样参照。如水稻适宜时期颖壳淡黄绿色，雄蕊长度达颖壳的1/3～1/2；马铃薯在花冠露出萼片一半时大多数花粉处于单核晚期。

② 材料预处理　接种前对花蕾和花序以理化方法处理提高花粉植株的诱导频率。方法包括：低温、离心、低剂量辐射、化学试剂处理等。如禾本科植物带叶鞘和穗子用纱布包好放入塑料袋中，置于冰箱中冷藏，植物不同温度不同，柑橘3℃，5～10d，作用是保持花粉活力，同时提供能量。

③ 表面消毒　适宜于接种用的花药，都还处在未开花的幼花或花蕾中，由花被或颖片等包被，本身是无菌的，因此，只要对幼穗或花蕾进行表面消毒就可以。一般用70%乙醇擦拭表面，使之浸润30s，再用0.1%HgCl₂浸泡5～10min或用饱和的次氯酸钠浸泡10～20min。　　

④ 接种　将消毒过的材料（幼穗、花蕾等）置于超净工作台上，无菌剥取花药进行接种，操作时要小心、不要损伤花药，因为花药受损后可能刺激药壁细胞形成二倍体的愈伤组织，如果是花药较大的材料，可用解剖刀或镊子剥开花蕾，用镊子夹住花丝，取出花药。如果是花器很小的植物，如天门冬属、芸苔属和三叶草属植物等，可能需要借助显微镜夹取花药，或只把花被去掉，将其余部分接种在培养基上。

⑤ 培养　花药培养一般在温度25～28℃、光照2000～10000lx和光周期12～18h的条件下进行培养。

⑥ 植株的诱导　由花药培养诱导花粉植株的形成有两条途径：一是由花粉粒的异常发育形成胚状体，再由胚状体发育长成花粉植株；二是由花粉粒的多次分裂形成愈伤组织，再由愈伤组织进一步器官分化，形成芽和根，最后形成完整植株。

（2）花粉培养

① 花粉的分离

a．挤压法　将合适发育时期的花蕾取下，表面消毒，无菌水洗净后，取出花药，放入盛有少量液体培养基或与培养基等渗的蔗糖溶液的烧杯中，用平头的玻璃棒或注射器内管轻轻挤压花药，使其散出花粉，过筛、离心。此方法的优点是操作简便，缺点是花粉中会混杂有体细胞。该方法对双子叶植物较为适用，但对禾谷类作物不太适用，并且容易损伤花粉粒。

b．磁拌法　将花药接种于含有液体培养基的三角瓶中，然后放入一根磁棒，置于磁力搅拌器上，低速转至花药呈透明状。为了提高分离速度，在培养基中可加入几颗玻璃珠。此方法分离花粉比较彻底，但对花粉粒有不同程度的损伤。

c．自然释放法　首先将花药在液体培养基中漂浮培养3～7d，在此期间花粉粒从花药裂口处散落到培养液中。在直接分离花粉难于成功的情况下，用自然释放法能取得成功。

d．小孢子的分离纯化　无论是哪种方法提取的小孢子匀浆，都需要去除杂质，这就需要过筛、离心收集等步骤。过筛时筛孔径的大小由小孢子的大小决定。采用级联过筛时，第一级可选用孔径大些的以便把大的杂质去掉，最后一级选用略大于小孢子直径的筛子，过筛后离心收集小孢子进行培养。

② 培养基

a．基本培养基　MS和H培养基适合于双子叶植物花药培养； Nitsch培养基适合芸苔属和曼陀罗属植物花药的培养；B₅培养基比较适合于豆科和十字花科植物； N₆培养基较适合于禾谷类植物。

b．植物生长物质的种类和浓度　生长素类2，4-D促进愈伤组织形成，但抑制愈伤组织产生胚状体。细胞分裂素促进花粉分化成胚状体。

c．蔗糖浓度　在花药和花粉培养中用麦芽糖代替蔗糖效果较好。浓度大多数为2%～4%。　

d．有机附加物　花药培养中添加天然有机附加物，如水解乳蛋白、椰子汁、玉米汁等对于提高花粉愈伤组织和胚状体诱导率，促进其生长有良好的效果。

③ 花粉培养方法

a．预培养　将花药在液体培养基中先漂浮培养2～4d，在5mL液体培养基中可培养约50个花药，然后挤出花粉，经离心洗涤纯化后悬浮于液体培养基中进行培养，待愈伤组织或胚状体形成后，转入分化或胚发育培养基上生长。

b．直接培养　直接培养是指从不经预培养或预处理的新鲜花药中直接分离出花粉粒，接种到培养基中进行培养的方法。

c．看护培养　用花药或一块愈伤组织来哺育单细胞，从而使其正常分裂、增殖的方法，称“看护培养”。具体做法是将完整花药接种在琼脂培养基上，将一片无菌滤纸放在花药上，再将花粉粒接种在滤纸上，培养1个月后，在滤纸上形成细胞群落（图3-5）。

d．微室培养　用滴管取1滴悬浮有花粉的液体培养基，滴在盖玻片上，然后翻过来放在一凹穴载玻片上，盖玻片四周用石蜡密封。这种方法的优点是便于在整个过程中进行连续的活体观察，可以把一个细胞生长、分裂和形成细胞团的全过程记录下来。缺点是培养基太少，水分容易蒸发，使培养基中的养分和pH值容易发生变化，影响花粉细胞的进一步发育。

④ 单倍体植株染色体加倍

a．花粉植株的倍性　由花药培养产生的花粉植株多数是单倍体，还有二倍体、三倍体及非整倍体。日本研究人员发现水稻和茄属的花粉植株中，从单倍体至五倍体都有。黄佩霞等对2496株水稻花粉植株染色体数目统计的结果是单倍体35.3%、二倍体53.4%、多倍体与非整倍体5.3%、不同倍性混生植株占6.1%。这些变化中，非单倍体可能来源于花药体细胞如药壁或花丝细胞，由它们形成二倍体愈伤组织，再分化出二倍体植株，或者来自于单倍体细胞的自主加倍，或来自于雄核发育过程中的核融合。

b．单倍体植株的染色体加倍　单倍体植株营养体瘦小，只含一套染色体而不能进行正常减数分裂，不能开花结实，需经加倍处理使之成为纯合二倍体，才能恢复育性，在育种上才有价值。单倍体植物染色体加倍有以下三条途径。

（a）自然加倍　通过花粉细胞核有丝分裂或核融合染色体可自然加倍，从而获得一定数量的纯合二倍体。但尚有许多单倍体植株需采用人工方法加倍处理。自然加倍的优点是不会出现核畸变。

（b）人工加倍　诱导染色体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。处理方法有小苗浸泡方法、芽处理、浸根方法或浸泡分蘖节方法等。以双子叶植物烟草为例，把具有3～4片真叶的花粉植株浸于过滤消毒的0.4%秋水仙碱溶液中24～28h，然后转到生根培养基（T培养基）上，使其进一步生长。也可将含有秋水仙碱0.2%～0.4%的羊毛脂涂在其顶芽或上部叶片的腋芽上，去掉主茎的顶芽，促进侧芽长成二倍体的可育枝条。禾本科植物染色体加倍，一般要在秋水仙碱溶液中加有助渗剂二甲亚砜（1%～2%）浸泡分蘖节。

（c）愈伤组织加倍　将单倍体植株的叶、茎、叶柄和根等器官切成小块后置于一种适当的培养基上，诱导形成愈伤组织，经过继代培养之后，转移到分化培养基上，由此所获得的再生植株中，将会有染色体加倍的植株。另外，在花药（粉）愈伤组织增殖过程中，往往可通过核内有丝分裂使染色体加倍（图3-6）。延长愈伤组织培养的时期，可提高染色体加倍的频率，但过分延长愈伤组织培养的时间，将会降低或丧失其再生植株的能力。

⑤ 花药和花粉培养的应用

a．单倍体植物在育种中的作用　将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合的二倍体，从中选出具有优良性状的个体，直接繁育成新品种，或选出具有单一优良形状的个体，作为杂交育种的原始材料，称之为单倍体育种。下面介绍单倍体植物在育种中的应用。

（a）克服后代分离，加快育种速度　通过常规杂交育种要获得一个稳定的品系需5～7年，获得一个新品种需8～10年。采用单倍体育种只需2～3年。常规育种中杂交后代自第二代（F₂）起开始分离，要持续到F₆代后才能趋于稳定，通常在F₅代、 F₆代才开始选择，再经品种比较、示范种植、推广等程序，育成一个品种需8～10年。而用单倍体技术，从F₁代进行单倍体诱导，得到单倍体植株，加倍后就成为稳定的纯合二倍体，其下一代植株形状基本稳定，因而可根据田间表现进行选择，入选株系即可参加比较试验、品种鉴定等，这样大大加快了育种速度。

（b）提高选择效率　可用2对基因的遗传特性来分析，假设用于杂交的母本的基因型为AAbb，父本的基因型是aaBB，通过杂交希望后代中得到具有AABB基因型的新品种。可知母本经减数分裂产生的卵细胞的基因型是Ab，父本经减数分裂后产生精子的基因型是aB，因此杂交后的杂种F₁的基因型是AaBb，由于F₁代的基因型都是一样的，所以表现遗传性状整齐一致，F₁代不会发生分离现象。F₁代进行有性生殖时，要进行减数分裂，同时基因重新自由组合，将产生4种类型的卵细胞和4种类型的精子，两者都包括4种基因型，即AB、Ab、aB、ab，在常规杂交过程中，F₁代这4种类型的精子和4种类型的卵子随机结合，F₂代即产生16种基因型，这就是杂种的分离现象。如果从中选择AABB，则其选择的概率是1/16。如果用单倍体育种，通过人工培养F₁代花药，其中花粉只有4种类型，产生的单倍体植株也只有4种类型即AB、Ab、aB、ab，经过染色体加倍得到纯合二倍体即AABB、Aabb、aaBB、aabb。这样4株中就有1株是所需要的AABB，选择概率为1/4。可见在2对等位基因存在的情况下，常规杂交育种法与单倍体育种方法，其选择效率之比为（1/16）∶（1/4），后者比前者提高了4倍。在正常的杂交育种中，等位基因数量远远大于2对，选择效率则有更大的提高，这种推理已被多年来单倍体育种的实践所证明。例如，3对等位基因选择效率可提高8倍，4对等位基因可提高16倍，5对等位基因可提高32倍等，等位基因越多，选择效率提高越明显。

通过育种过程获得纯种可以直接作为新品种，也可以作为F₁代的亲本。目前，由于杂交优势的利用，以F₁代作为种子的应用范围日益广泛，选择F₁代必须有大量纯种作为基础，单倍体育种为提供纯种创造了快速有效的方法。

（c）快速获得自交系的超雄株　异花授粉植物玉米、高粱和洋葱等，利用杂种优势，可使产量大幅度提高，但必须掌握一定数量的高纯度自交系。通常采用连续人工自交方法，获得一个自交系至少需6年。而通过花药培养产生单倍体植株，再加倍使之成为纯合二倍体即标准自交系，只需1年时间。这一新技术加速了自交系培育，促进了异化授粉植物杂种优势的利用。

在一些雌雄异株蔬菜（石刁柏、芦笋）生产上，需栽培均一的雄株群体，因雄株纤维少、蛋白质含量高、产量高，很受消费者和生产者欢迎。但一般栽培用的种苗是通过雌株（XX）和雄株（XY）受粉产生的种子形成的，因而雌株和雄株的比例是各占50%，不可能是100%的雄株。用单倍体诱导的办法，从雄株花药培养得到只含有Y染色体的单倍体植株，加倍后得到超雄株（YY），将超雄株与雌株杂交，后代就得到100%的雄株。

（d）有利于隐性基因控制性状的选择　杂种中隐性基因经常被显性基因掩盖，而单倍体育种是从加倍后的纯合二倍体中选择，因隐性基因被加倍而纯合，不存在隐性基因被掩盖的性状。

b．我国单倍体育种的成就　据统计至今已有10个科24个属250多种高等植物的花药培养成功，其中有50多种植物（如小麦、玉米、大豆等）是我国首先培育成功的。

8．细胞培养

细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名称为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养既包括微生物细胞的培养，也包括细胞培养技术。可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

（1）单细胞培养

① 单细胞的分离

a．由植物器官分离单细胞

（a）机械法　叶片组织的细胞排列疏松，是分离单细胞的最好材料，先把叶片轻轻研碎，然后再通过过滤和离心将细胞净化。如Gnanam和Kulandaivelu由几个物种的成熟叶片中分离得到具有活性的叶肉细胞，具体方法是在研钵中放入10g叶片和40mL的研磨介质，用研杆轻轻研磨，然后用两层细纱布过滤，再研磨介质中低速离心，净化细胞。该种方法的优点是细胞不受酶的伤害，无需质壁分离，对生理和生化研究来说是理想的，但机械法并不普遍适用。

（b）酶解法　酶解法是利用果胶酶由叶片组织分离单细胞的常用方法，具体的做法是取幼嫩的完全展开叶，进行表面消毒后用无菌水冲洗，用消毒的镊子撕去表皮，用消毒的解剖刀切成4cm×4cm的小块。取2g切好的叶片置于装有20mL无菌酶溶液的三角瓶中，酶溶液组成为0.5%的果胶酶、0.8%的甘露醇、1%硫酸葡聚糖钾。用真空泵抽气，使酶渗入到叶片组织中，将三角瓶置于往复式摇床上，120r/min，25℃，2h。其间每隔30min更换溶液一次，将第一个30min的溶液弃掉，第二个30min后的酶溶液主要含有海绵薄壁细胞，第三个和第四个30min的酶溶液主要含有栅栏细胞，用培养基将分离得到的单细胞洗涤两次即可培养。

b．由愈伤组织分离单细胞　诱导得到的愈伤组织转移到装有适当液体培养基的三角瓶中，置于水平摇床上，在80～100r/min培养条件下获得悬浮细胞液，再以4000r/min离心，获得纯净的细胞悬浮液。再用孔径为60～100μm的细胞筛过筛，然后再用孔径为20～30μm的细胞筛过筛，进行离心，回收获得的单细胞，并用液体培养基洗净，进行培养。

② 培养方法　单细胞培养方法有三种，即看护培养法、微室培养法和平板培养法。

a．看护培养法　看护培养是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法（图3-7）。具体做法是在无菌条件下将处于活跃生长期的约1cm大小的愈伤组织块放到已灭菌的装有1cm厚培养基的三角瓶中。把一块1cm见方的灭过菌的滤纸，在无菌条件下置于该愈伤组织上，几天后，借助于一个微型移液管或微型刮刀，从细胞悬浮液中或易散碎的愈伤组织上分离得到细胞，置于愈伤组织之上的湿滤纸表面。当这个培养的细胞长出了微小的细胞团之后，再转至琼脂培养基上。该种方法简便易行，效果好，但无法在显微镜下观察细胞的生长状况，因此必须保证接种的是真正的单细胞。

b．微室培养法　由悬浮培养物中取出一滴含单细胞的培养液，置于一张无菌载玻片上，在该滴培养液的四周涂上一圈四环素眼膏，然后在四环素眼膏上放一段毛细管，然后将消毒的盖玻片盖在四环素眼膏上，并于眼膏紧密接触。这样一滴含有单细胞的培养液就被覆盖于微室之中，最后把筑有微室的整张载玻片置于培养箱或培养室中进行培养。当细胞团长到一定大小时，将培养物转移到新鲜的液体或固体培养基上培养。通过微室培养技术，可对细胞培养过程连续进行显微观察，了解一个细胞经过生长、分裂、分化，形成细胞团的全部过程。

c．平板培养法　平板培养法是指把单细胞与溶化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿的底上的培养方法。具体做法是将制备好的单细胞培养液进行细胞计数，离心收集已知数目的单细胞，根据平板培养要求的密度和悬浮液的实际密度进行调制。一般平板培养要求的细胞密度（1×10³）～（1×10⁵）个/mL，若悬浮液与培养基按1∶2混合，则应把悬浮液的细胞密度调至（2×10³）～（2×10⁵）个/mL，高于此值，加培养基稀释，低于此值，离心吸取上清液。将与上述培养基成分相同但加入0.6%～1.0%琼脂的培养基加热溶化，冷却到35℃时，将培养基2份与上述细胞悬浮培养液1份混合，迅速注入并使之铺展在培养皿中，约3mm厚（图3-8）。在35℃温度下，培养基能保持液体状态，也不会杀死细胞。用封口膜封严培养皿，置于25℃黑暗中培养。该方法培养细胞可以定期镜检观察细胞的生长。

用平板法培养单细胞时，常以植板效率表示能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分数，计算公式为：

一般悬浮培养液要达到最终所要求的植板细胞密度的2倍，可以通过加入液体培养基进行稀释，或通过低速离心使细胞沉降，弃去部分培养基进行浓缩。

d．纸桥培养法　纸桥培养法是植物茎尖组织培养常用的方法，也可用于单细胞培养。具体方法是把滤纸两端浸入到液体培养基中，中央露出培养基表面形成纸桥，将培养的细胞放在纸桥中央进行培养。1976年Bigot将该方法进行了改进，特制了一种三角瓶，使其底部的中央部分向上突起，在突起处放上滤纸，这种方法的优点是培养物不易干燥（图3-9）。

③ 影响单细胞培养的因素

a．培养基成分　培养基的成分是影响细胞培养的关键因素之一，当细胞的植板密度较高时，使用和悬浮培养或愈伤组织培养中成分相似的培养基即可成功。因此，可利用生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基培养单细胞，促进单细胞的正常生长和分裂。由于细胞和组织在生长过程中向培养液释放了能促进细胞分裂的一些特殊代谢物，使得这种培养基营养更加丰富，从而有利于单细胞进行生长和分裂。因而当在某种植物或组织的培养中遇到困难时，向培养基加入该植物的汁液，有时会收到良好的效果。

b．细胞密度　单细胞培养要求植板的细胞有一个标准的临界密度才能促进其分裂和发育，低于该临界密度，培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团。植板的密度不是一成不变的，当培养基的成分越复杂，营养成分越丰富时植板细胞的临界密度越低；反之，植板密度要求越高，一般要求至少每毫升在1000个细胞以上。

c．生长物质　在单细胞培养中，补充生长物质是非常重要的，它可以非常有效地提高植板效率。如在低密度中，旋花细胞培养必须加入细胞激动素和一些氨基酸，才能开始生长和分裂。

d. pH值　适当调整培养基的pH值也能够提高细胞培养的植板效率。如在假挪威槭的悬浮细胞培养中，在合适的培养基条件下，把pH值小心地调到6.4，其起始细胞的最低有效密度可从（9×10³）～（15×10³）个/mL降低至2×10³个/mL。

e. CO₂　大气中的CO₂对细胞培养也有一定的影响，当人为降低瓶内CO₂浓度时细胞停止分裂。当提高到含量为1%时则能促进细胞生长，继续提高当含量达到2%时反而起抑制作用。

（2）细胞悬浮培养　细胞悬浮培养是指将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。它是从愈伤组织的液体培养技术基础上发展起来的一种新的培养技术，能够提供同步分裂的、增殖迅速的大量细胞，可用于大规模的工业化生产。

① 筛选细胞株的方法　从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快、颜色浅的愈伤组织，用振荡或酶法，游离出来单个细胞或小细胞团，接种在固体的培养基上培养2周，从中挑选生长快的细胞株并进行继代，筛选出有效成分高而生长快的细胞株。

② 培养方法

a．成批培养　成批培养是指将一定量的细胞或细胞团分散在含有固定体积的培养基的容器系统中的培养，它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。

成批培养的容器一般选用100～250ml的三角瓶，每瓶装20～75ml的培养基。其特点是细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的养分耗尽为止。在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞生长周期表现为S曲线，即初期增长缓慢，称延迟期，特点是细胞很少分袭补细胞数目增加不多；中期生长最快，称对数生长期，特点是细胞数目迅速增加，增长速率保持不变；随后细胞增长逐渐减慢，称减缓期，特点是由子养分供应差和代谢物积累、环境恶化，细胞分裂生长减慢；最后细胞生长完全停止，称静止期，其特点是养分基本耗尽，有害代谢物积累，导致细胞分裂停止，直至开始死亡。成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。再培养过程中要用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在培养基中的均匀分布。

成批培养的方法根据培养基在容器中的运动方式来区分，有以下四种方法。

（a）旋转培养　培养瓶呈360°的缓慢旋转移动，1～5r/min，使细胞培养物保持均匀分布和保证空气供应。

（b）往返振荡培养　机器带动培养瓶在一直线方向往返振荡。

（c）旋转振荡培养　机器带动培养瓶在平行面上作旋转振动， 40～150r/min不等。

（d）搅动培养　利用搅拌棒的不断转动搅动培养基。

b．连续培养　连续培养是指在培养的过程中，以不断注入等量新鲜培养基，倒掉用过的培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的大规模细胞系培养方式。

连续培养又有封闭式和开放式连续培养之分。封闭式连续培养是指新鲜培养液和老培养液以等量进出，并把排出细胞收集，放入培养系统继续培养，所以培养系统中的细胞数目不断增加；开放式连续培养是指在连续培养期间，新鲜培养液的注入速度与细胞悬浮液的排出速度相等，并通过调整流入与流出的速度，使培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值得恒定水平。开放式连续培养可分为两种形式：一种是化学恒定式；另一种是恒定式浊度。化学恒定法是按照某一固定速度，注入新鲜培养基内的某种选定营养成分，该种成分的浓度被调节成为一种生长限制浓度，从而使细胞的增殖保持在一种稳定的状态。而细胞生长速率与细胞特殊代谢产物形成有关。因此，这一关系就可以生产出最高产量的某种代谢产物，如蛋白质、有用药物等。这个方法在大规模细胞培养的工业上有巨大的应用潜力，是植物细胞培养方面的一大进展。浊度恒定法是根据悬浮液混浊度的提高来注入新鲜培养液的开放式连续培养。悬浮液的混浊度受到细胞密度控制。细胞增加，混浊度增大。可以预先选一个细胞密度，培养系统中细胞密度超过此限时，其超过的细胞就会随排出液一起自动排出，从而能保持培养系统中细胞密度的恒定。

c．半连续培养　指每隔一定时间后倒出一定量的悬浮液，并同时补充等量的新鲜培养液，这相当于成批培养时频繁地进行再培养，半连续培养能重复地取得大量、均一的培养细胞供生物研究之用。该种方法在玉米、花生、菜豆等多种植物上进行应用。

③ 悬浮培养细胞同步化　同步培养是指在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。而在细胞悬浮培养中细胞是随机分裂的，因此在一般情况下，悬浮培养细胞都处于不同发育期或不同分裂期的，即是不同步的。为了研究细胞分裂和细胞代谢，一般使用同步培养物或部分同步培养物。

同步性的程度以同步百分数表示。为了取得一定程度的同步性，研究者已进行了各种尝试。如King等指出，同步性程度除由有丝分裂指数来确定，还可以由某一瞬间处于细胞周期某一特定点上的细胞所占的百分数表示，也可以由一个短暂具体的时间内通过细胞周期某一点的细胞的百分数表示，或者全部细胞通过细胞周期某一点所需的总时间占细胞周期时间的百分数表示。

实现悬浮培养细胞同步化的方法主要有以下两种。

a．饥饿法　先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G₁期或晚期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同时进入分裂。如Komamine等（1978）在长春花悬浮培养中，先使细胞受到磷酸盐饥饿4d，然后再把它们转入到含有磷酸盐的培养基中，结果获得了较高的同步性；烟草悬浮培养细胞受细胞分裂素的饥饿后获得同步；胡萝卜细胞受生长素饥饿后也取得了同步化的效果。

b．抑制法　使用DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶、胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当细胞受到这些化学药物处理后，由于这些核苷酸类似物的存在阻止了DNA的合成，细胞周期只能进行到G₁期，细胞都滞留在G₁期和S期的边界上，当把这些抑制剂除去后，细胞就进入同步分裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细胞周期，细胞的同步化程度更高。

④ 细胞增殖测定

a．细胞鲜重与细胞干重　将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，称重，即求得细胞鲜重。用已知重量的干尼龙丝网依上述方法收集的细胞，在60℃下干燥48h或80℃下干燥36h，烘到恒重后，再称重，得细胞干重。细胞干重以每毫升培养物或每10⁶个细胞的重量表示。

b．细胞密实体积　将一已知体积的均匀分散的悬浮液（10～20mL）放入一个15～50mL的离心管中，在2000～4000r/min下离心5min，得到细胞的沉积体积。细胞密实体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。

当悬浮液的黏度较高时，常出现细胞不沉淀的现象，这种情况下可用水稀释至2倍。但是，用水稀释后渗透压过于下降时，会出现细胞变形，将得不到真正的细胞密实体积，所以用水稀释时尽可能以最低限度进行，并且动作要迅速。所用离心机的转头，应是悬式水平转头，这样沉淀物表面不会出现斜面，有利于正确测定。在测定细胞体积时，有时也用这样的方法：使细胞自然沉淀，测定其体积，称为沉淀体积。

c．细胞计数　计算悬浮细胞数即细胞计数，通常用血球计数板。计算较大的细胞数量时，可以使用特制的计数盘。

由于在悬浮培养中总存在着大小不同的细胞团，因而由培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞计数。因此应先用5%～8%铬酸或0.25%果胶酶对细胞和细胞团进行处理，使其分散，这样可提高细胞计数的准确性。Stree及其同事对假挪威槭细胞计数的方法：把1份培养物加入到2份8%三氧化铬溶液中，在70℃下加热2～15min，然后将混合物冷却，用力振荡10min，用血球计数板进行细胞计数。用这些物质处理时，有时细胞会被破坏，或者出现变形，所以对每种材料应研究其最适宜的处理方法。

⑤ 培养的条件

a．培养基　一般能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养基也能同样适用于该物种的悬浮培养。同时培养基成分对细胞培养的生物量和有用产物含量的提高都有密切关系，要协调好这两者的关系。最主要的是要根据不同种类的培养细胞选择适当的碳源（蔗糖或葡萄糖、果糖、半乳糖），氮源（硝态氮、铵态氮、有机态氮）以及其他添加物（如前体、生长物质）。

生长物质是细胞培养中不可缺少的物质，通过它可控制某些细胞培养物的一些有用产物的生产，如加入2，4-D往往阻止多种细胞的有用物生产，但它可使人参皂苷的产量显著提高。

b．光照　光照对细胞的生长和有用物质的生产有极大影响，如芸香的愈伤组织在光照下培养，其芳香化合物的含量比暗培养下增加1.5～3.6倍。但光也存在抑制作用，抑制某些化合物产生，如蓝光和白光能使紫草素合成受阻，萜烯类合成也能被蓝光和强白光抑制。

c．氧浓度　胡萝卜细胞悬浮培养中存在着两种再生小植株的途径，即先形成根，再长出小植株，或经由胚状体成苗。这与液体培养基中存在的溶解氧浓度有关，当培养基中的氧浓度低于临界水平时，有利于胚状体形成，而氧浓度高于临界水平又有利于根的形成。

d．培养基的振荡　细胞悬浮培养中为使愈伤组织破碎成小细胞团和单细胞，并均匀分布在培养基中，促进气体交换，应对培养物进行振荡培养。成批培养一般采用摇床，常用的摇床有水平往复式，转速为60～150r/min；旋转式摇床转速1～5r/min。连续培养通常在培养装置上安装搅拌器。

⑥ 悬浮培养细胞植株再生　由悬浮培养细胞再生植株的途径有两种：一种是由悬浮细胞直接形成体细胞胚，即悬浮细胞首先活跃分裂，形成球形胚，再形成心形胚、鱼雷形胚、最后发育成具有子叶、幼根的成熟胚，在培养条件适宜的情况下继续发育形成正常的植株，如图3-10所示；另一种是先将悬浮细胞或细胞团转移到半固体或固体培养基上，使其增殖形成愈伤组织，然后再由愈伤组织再生植株。

⑦ 细胞悬浮培养的应用

a．植物有用物质的生产　植物的很多次生代谢物是药用成分、色素、染料、香精、生物碱、糖、酶等的重要来源，但这些天然产物的含量低，难以满足人类的需求，大规模生产又存在许多的困难。在植物组织培养研究中，发现培养细胞中同样含有这些代谢产物，其中有一些是人工不能合成的。因此，可用大规模细胞培养生产这些有用物质，使之由大田生产走向工厂化生产。

具体的方法如下。首先在进行工业生产之前，一定要选择一种适合于培养材料快速生长且合成有效成分效率高的培养基，这需要针对某一特定的材料大量筛选才能获得。可采用目前广泛应用的一些标准培养基进行试验，如MS（1962）、Miller（1963）等。然后从特定的植物材料诱导愈伤组织，从愈伤组织中分离单细胞，在平板培养中，单个细胞经持续分裂，形成许多细胞株。这时先选择生长快、疏松、分散好的细胞株，再经目的产物的定量测定，从中筛选出目的产物含量高的高产单细胞，从而建立高产细胞系，对高产细胞系进行扩大繁殖，以获得足够的培养细胞用作大量培养时的接种材料，用作扩大培养的容器为摇瓶，即1000～3000mL的三角瓶。在培养过程中，要经常鉴定细胞株，并进行提纯，防止细胞株退化和变异。最后用发酵罐或生物发生器进行大量培养，以生产所需要的植物化合物。

b．诱发和筛选突变体　在细胞培养过程中会产生一些突变体，常采用不同的培养基来进行选择，也就是把悬浮细胞培养于缺少某种营养物质或生长因子，或是添加某种抑制剂的培养基里，使突变细胞和正常细胞区别开来，从而把突变体选择出来。这种诱导变异是高等植物育种的途径之一。到目前为止，通过细胞诱变已获得了一批具有优质、抗病、抗逆等特性的突变体。

c．用于原生质体培养和细胞器分离　利用细胞悬浮培养方法对细胞原生质体进行分离，在适宜的培养基上进行培养，使之形成完整的植株，或者对原生质及细胞内的细胞器、细胞膜及多种成分观察、分离、研究，有利于植物代谢生理学、生物化学等的研究。

d．食品生产　科学工作者研究将培养的细胞作为人的非常规食物来源。通过对许多食用植物培养组织的细胞团生产的研究，确定在利用培养细胞作为食物前，必须先要大幅度提高细胞的生长速度才有经济价值。有人比较了一般栽培作物产量和培养细胞的产量，认为培养细胞的产量和作物产量在增长幅度上是相同的。但要使培养细胞优于农业生产的话，细胞的产量至少要比农业生产大十倍。

与粮食、蔬菜相比较，将培养细胞作为食物时，在培养细胞中有可能分离得到一些具有很高营养价值的蛋白质，可制作人造肉等。用培养细胞来生产这种含量高、营养丰富的蛋白质，作为常规食品的辅助成分，在经济上是可行的。有的研究者指出，培养细胞约含35%的蛋白质、18%脂肪、20%糖类，这比大多数作物更有营养。Garnborg等检查了12种植物的培养细胞，发现其总蛋白质含量达27%～35%，可溶性蛋白占干重的1.7%～2.7%，必需氨基酸的量尤其是碱性氨基酸和蛋氨酸的量高于种子。

9．原生质体培养和细胞融合

植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术，它是20世纪60年代初，人们为了克服植物远缘杂交的不亲和性，利用远缘遗传基因资源改良品种而开发完善起来的一门技术。植物原生质体是遗传转化的理想受体，能够比较容易地摄取外来遗传物质，如外源DNA、染色体、病毒、细胞器等，为高等植物在细胞水平或分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系。

原生质体指的是用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有“全能性”，可以经过离体培养得到再生植株。目前已有49个科160个属的360多种植物经原生质体培养得到了再生植株。

植物原生质体培养和细胞融合技术已经成熟，并成为品种改良和创造育种亲本资源的重要途径。迄今已在多种作物上获得了原生质体植株和种、属间杂种植株，也为细胞生物学、植物生理学及体细胞遗传学研究做出了重要贡献。

（1）原生质体培养

① 材料来源和预处理

a．材料来源　供体材料是影响原生质体培养成功与否的关键因素之一，不但影响原生质体分离的效果，也影响原生质体的培养效果。一般来说根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。目前较多采用叶片来分离原生质体，其叶肉组织是游离原生质体的一种良好材料，但分裂旺盛、再生能力强的愈伤组织或悬浮细胞，尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。

（a）叶肉细胞　叶肉细胞是分离原生质体的良好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，要考虑植株的生长环境、叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，应在光强3000～6000lx、温度20～25℃、相对湿度60%～80%的条件下培养。

（b）细胞悬浮培养物　在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在含2～4mg/L的2，4-D的MS固体培养基上，在26℃黑暗条件下诱导愈伤组织，每隔2～4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到装有液体培养基的100mL三角瓶中进行悬浮培养，用旋转式振荡器，速度控制80～120r/min，于25℃下暗培养，悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4～5mL悬浮细胞到250mL三角瓶的40mL新鲜培养基中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3～4月后，使悬浮细胞大小达到一致，且细胞质变得较浓时，便可用于分离原生质体之用。

b．植物材料的预处理　为提高原生质体的产率和活性，逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境，进行原生质体分离前要进行预处理。包括低温处理和等渗溶液处理。

（a）低温处理　叶片为外植体材料时，在分离原生质体前，先把材料放在4℃以下的低温条件下，让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，均匀一致、分裂频率高。

（b）等渗溶液处理：把材料放在等渗溶液中数小时，再放到酶溶液中分离原生质体，可以提高其产量和活性，如苹果、梨等采用该种方法较好。在很多情况下材料不必经过专门的预处理也是可以的。

② 原生质体的分离

a．机械法　首先使细胞发生质壁分离，然后切开细胞释放出原生质体。该种方法优点是它能够排除外加酶对离体的原生质体的结构与代谢活性的有害影响。但原生质体的产量低，方法繁琐费力，因此没有得到广泛的应用。

b．酶法

（a）酶的种类　植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质。纤维素占细胞壁干重的25%～50%不等；半纤维素平均约占细胞壁干重的53%左右；果胶质一般占细胞壁的5%。 分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

纤维素酶：常用的商品纤维素酶是Cellulase Onozuka RS和Cellulase Onozuka R-10，其纯度高，毒害小，常用浓度为0.5%～2.0%，主要含有纤维素酯Cl（β-1，4葡聚糖酶）和纤维素酯Cx（β-1，4葡聚糖纤维二糖水解酶）。纤维素酯Cl作用于天然的和结晶的纤维素，具有折断天然纤维素的作用；纤维素酯Cx，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素；另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，总体作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体。

半纤维素酶：可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。常用的是RhozymeHP150，常用浓度为0.1%～0.5%。主要成分是β-木聚糖和β-甘露聚糖，为内切酶，切断主链内的糖苷键。

果胶酶：常用的果胶酶有Macerozyme R-10（离析酶，主要成分是果胶酶）、Pectalyase Y-23（离析软化酶）。Macerozyme R-10的活性较高，但含杂酶也较多，如使用浓度过高，时间过长，则有毒害作用，浓度一般在0.5%～2.0%。Pectalyase Y-23的活性极高，一般叶片使用量为0.1%，悬浮细胞0.05%。主要成分是解聚酶和果胶质酶，催化果胶质水解，把细胞从组织内分离出来。

（b）分离方法　酶分离法可分为两步法和一步法。

两步法是先用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用纤维酶处理单细胞，分离原生质。其优点是得到的原生质均匀一致、质量好，但操作复杂，现已逐渐被淘汰。

一步法相对两步法则操作简单，因此目前多被采用。具体方法如下（以叶片为例）。最好利用再分化能力强的愈伤组织或悬浮培养细胞或无菌苗的组织器官。如果利用自然环境下栽培的植株叶片，应选取生长健壮的植株上充分展开的较幼嫩叶片，经洗涤剂洗涤和流水冲洗后，进行常规消毒和预处理后待用。然后配制酶液，根据实验材料确定合理的酶液组合，应注意酶制剂的种类、配比及酶液的pH值。称取纤维素酶、果胶酶以及渗透压稳定剂等配成酶液，将酶液离心（2500～3000r/min）后，用0.45μm的微孔滤膜过滤灭菌，分装后－20℃冷冻保存。为了提高原生质体膜的稳定性，一般在酶液中添加CaCl₂·2H₂O和葡聚糖硫酸钾。将叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中，如果是幼嫩叶片，应尽量撕去下表皮或除去茸毛，切成1～2mm的细条。用量为0.05～0.1g组织/mL酶液，真空泵抽引渗透处理5min，以促进酶液渗透，然后置于往复振荡式摇床上（30～40r/min），26℃酶解处理2～8h。酶解处理期间可用解剖针轻轻破碎叶片组织，有利于原生质体的游离释放，提高其产量。

在原生质体分离时细胞壁一旦去除，裸露的原生质处于内外渗透压不同的情况下，很有可能立即破裂。因此，在酶液中必须加渗透压稳定剂代替细胞壁对原生质体起保护作用。常用的渗透压稳定剂有糖溶液系统和盐溶液系。糖溶液系统包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖等。其浓度在0.4～0.6mol/L。其中甘露醇和山梨醇等糖醇一般用于游离叶肉等材料的原生质体；葡萄糖则常用作悬浮细胞的原生质体渗透稳定剂。糖醇不易被原生质体吸收，当细胞壁重新形成，细胞分裂形成小细胞团时必须降低糖醇浓度，以免妨碍细胞增殖和生长。糖因易被吸收而造成渗透压降低导致原生质体破裂，故一些研究者既用糖也用糖醇，例如各用一半，效果较好。盐类采用如CaCl₂、KCl、KH₂PO₄、葡聚硫酸钾等含钙、钾、镁等离子的溶液。

酶液的原始pH值对原生质体的产量和活力影响很大，一般pH值以5.4～5.8为宜，降至4.8时则原生质体破裂。

③ 原生质体的纯化　酶解后的混合物包括解离酶液中有原生质体、破碎细胞的细胞器等，也有未解离的组织或细胞，因此要进行纯化，获得纯净的原生质体。

a．沉降法　该方法利用相对密度原理，低速离心使原生质体沉于离心管底部。首先用孔径为30～40μm的微孔滤膜过滤酶混合液，清除较大碎屑，将滤液置于离心管，从500～1000r/min低速离心3～6min，原生质体沉于离心管底部，残液碎屑悬浮于上清液内，用吸管小心地吸掉上清液，弃去上清液，再用甘露醇溶液或专用洗涤液（0.45mol/L甘露醇，10mmol/L CaCl₂·2H₂O，0.7mmol/L KH₂PO₄，pH5.6）洗涤原生质，反复2～3次，最后用原生质体培养液洗1次，放到1～2mL的液体培养基中备用。该方法的优点是纯化收集方便，原生质体丢失少，缺点是原生质体纯度不高。该方法是目前最为广泛采用的方法。

b．漂浮法　根据原生质体来源不同，利用密度大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。具体方法是在无菌条件下把5～6mL浓度较高的溶液（如20%的蔗糖溶液）加入10mL的离心管中，其上轻轻滴入1～2mL酶-原生质体混合液离心，使破碎的细胞或组织残片沉于底部，用吸管收集原生质体液层，用液体培养基或含有CaCl₂·2H₂O的甘露醇溶液洗涤2～3次，放到1～2mL的液体培养基中备用。该方法获得的原生质纯度高，但原生质的收集率低。

c．界面法　选用两种不同渗透浓度的溶液，原生质体的密度介于两种溶液密度之间，进行离心纯化原生质体。具体的方法是：采用沉淀法收集原生质体，用培养液再离心沉淀一次，沉淀重悬于2～3mL的培养液中。再向10mL的离心管中加入8mL 18%的蔗糖溶液，取2mL重悬液铺到上面，700r/min离心2min，则原生质置于培养液和蔗糖溶液之间的界面上，用吸管吸取，再用培养液离心洗涤一次，即可。

④ 原生质体活力测定　原生质体的活力强弱是原生质培养成功与否的关键因素之一。了解分离提纯的原生质体的活力，对修正酶液的组合和原生质体培养至关重要。因此，在前期必须对原生质体的活力进行测定，主要的测定方法有以下几种。

a．目测法　一般凭形态特征即可识别原生质体的活力，如形态上完整、细胞质丰富、颜色鲜艳的原生质体即为存活的。也可采用渗透压变化法，把原生质放到高渗或低渗溶液中，在显微镜下观察细胞流动性确定原生质体活力，如体积能随着渗透压的变化而改变，即为活的原生质。

b．荧光素二乙酸法（FDA） 用FDA染色后，在荧光显微镜下，无活力的原生质体不能产生荧光，并能计算出存活百分比。该种方法方便可靠，是目前最常用的方法。具体方法是将2mg FDA溶解到1mL的丙酮中作为母液，4℃冷藏贮存，贮藏期不宜过长。使用时先配置10mL的0.5～0.7mol/L甘露醇溶液，向该溶液加入0.1mL的FDA母液，最终浓度为0.02%。然后取一滴0.02%的FDA与一滴原生质体悬浮液在载玻片上混匀，25℃染色5～10min，用荧光显微镜观察，激发波长为330～500nm，活的原生质产生黄绿色荧光，发红色荧光的为无活力的原生质，用计数器计算存活百分率。

c．酚藏花红染色法　取适量的酚藏花红溶解于0.5～0.7mol/L甘露醇溶液，配成0.01%的母液，然后取一滴酚藏花红母液与一滴原生质体悬浮液混匀，25℃染色5～10min，用荧光显微镜观察，波长为527～588nm，活的原生质为红色，无活力的无色。

⑤ 原生质体培养的方法与条件

a．原生质体培养方法

（a）液体浅层培养　该方法使用液体培养基进行原生质体培养。将纯化后的原生质体用液体培养液调到一定的密度，约2×10⁵/mL。用吸管转移到6cm培养皿中铺一薄层，一般以1mm为宜，石蜡封口后进行培养。刚开始培养的1～2d需要经常轻轻地摇动，后静止培养，5～10d原生质体开始分裂。该方法的优点是操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点是原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步生长与发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。

（b）平板培养法　将纯化后的原生质体用液体培养液调到一定的密度，约2×10⁴/mL，与灭菌后等体积已溶解有1.4%低熔点琼脂糖的培养基均匀混合后，置于直径为6cm的培养基中，旋转培养皿，用石蜡封口后进行暗培养。培养基的厚度一般为2～3mm，培养5～7d原生质体开始分裂，该种培养方法优点是原生质体分布均匀，可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。缺点是操作要求严格，尤其是混合的温度掌握必须合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快，原生质体不容易混合均匀。

（c）液体-固体双层培养　该种方法是原生质体培养所有方法中效果最好的，即在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点是不易观察细胞的发育过程。

（d）悬滴培养法　将含有一定密度的原生质体的悬浮液用滴管滴在培养皿盖的内侧上，一般直径为6cm的培养皿滴6～7滴，皿底加入培养液或渗透剂等液体以保湿，快速将皿盖盖在培养皿上。这种方法所用的材料少，培养液的用量也少，有利于通风和观察。

（e）饲喂层培养　该方法是将饲喂层的细胞用培养基制作平板，该平板亦称饲喂层。用X射线照射，使核失活不能分裂，但细胞存活，然后将原生质体以液体浅层或平板技术铺在饲喂层上。

b．原生质体培养的条件

（a）原生质体的培养基　在多数情况下原生质体所用的基本培养基为MS、B₅、N₆、Nitsch和KM-8P培养基等；碳源大多数选用葡萄糖效果较好，但个别植物以蔗糖为佳；无机盐浓度和氮素浓度对原生质体培养影响较大，一般无机盐浓度不宜过高，大量元素浓度一般要低于愈伤组织培养基。适当增加Ca^2＋的浓度，能提高分裂细胞的百分数。对氮源来讲，有的植物适合使用氨态氮，而有些适合使用硝态氮，如葡萄原生质体最佳培养基是硝态氮型的B₅培养基。生长素和细胞分裂素的浓度配比在原生质体培养中起决定性作用。生长素主要使用NAA、IAA、2，4-D；细胞分类素主要使用BA、KT、ZT。

（b）光照　原生质体初期培养一般不需要光照，一般采用暗培养。最初4～7d分离出来的原生质体应在黑暗中培养；当细胞壁完整形成后，细胞具有耐光的特性，这时转入光下培养。

（c）温度　原生质体培养温度一般为27～29℃，因植物种类不同而有所差异，一般来说热带植物要求温度稍高，寒带植物要求温度稍低。

c．原生质体的发育与植株再生

（a）细胞壁再生　原生质体在培养后，首先体积增大，由球形逐渐变成椭圆形，一般原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天便可形成完整的细胞壁。细胞壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生细胞壁的原生质体也就不能进行正常的有丝分裂。再生细胞壁的鉴定一般采用卡氏白染色，具体方法是将卡氏白溶解在0.5～0.6mol/L的甘露醇中。然后用荧光色素溶液与原生质体混合，最终的浓度是0.1%，染色1min，用410nm以上的滤光镜片镜检，如果能看到蓝光，则说明细胞壁形成了，如果原生质体含有叶绿体，需要用滤光片除去红光进行观察。

（b）细胞分裂与生长　一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，但开始第一次分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。用幼苗的下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞、未成熟种子的子叶等为材料分离的原生质体一般比用叶肉分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。

（c）愈伤组织形成与分化　大多数情况下，原生质体培养2周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约6周后形成直径为2mm的小愈伤组织。原生质体培养7～10d后必须及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长。待小愈伤组织长至1mm左右时应及时转移到固体培养基上进一步生长。

（d）植株的再生　原生质体来源于细胞，其器官的发生途径有两条。一种是通过愈伤组织形成不定芽，当原生质体形成愈伤组织后直接转移到芽分化培养基，诱导芽的产生，再转移到根诱导培养基上，继而成苗；另一种途径是由原生质体再生细胞直接形成胚状体，由胚状体发育生成完整的植株。

（2）原生质体融合　体细胞杂交在植物中亦即原生质体融合，为克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离、扩大遗传变异等提供了一种有效手段。理论上讲，利用适当的物理或化学方法，可以将任何两种原生质体融合在一起；利用适宜的培养方法，可以由融合原生质体再生出杂种植株即体细胞杂种。

① 融合原理

a．化学法融合原理　带有阴离子的PEG分子等与原生质体表面的阴离子在Ca^2＋连接下形成共同的静电键，从而促进了原生质体间的黏着和结合。在高Ca^2＋-高pH液的处理下，Ca^2＋和与质膜结合的PEG分子被洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使原生质体的某些阳电荷与另一些原生质体的阴电荷连接起来，吸附聚合，最后融合在一起。

b．物理法融合原理　对融合槽的两个平行电极施加高频交流电压，产生电泳效应，使融合槽内的原生质体偶极化并沿着电场的方向排列成串珠状，再施加瞬间的高压直流脉冲，使黏合相邻的原生质体膜局部发生可逆性瞬间穿孔，然后，原生质体膜连接、闭合，最终融合。

② 融合类型

细胞融合类型包括对称融合、非对称融合。

a．对称融合　对称融合是指融合时，双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息，产生核与核、胞质与胞质间重组的对称杂种的技术，是植物体细胞杂交最初采用的融合方法，目前也广泛应用。

一般来说，对称融合多形成对称杂种，其结果是在导入有用基因的同时，也带入了亲本的全部不利基因，需要多次回交去掉不利基因，导致育种效率降低。同时对于有些不利性状因子因其与所需性状紧密连锁而无法去除。同时，种间杂种不育是体细胞杂交中存在的一个相当普遍的现象，特别是亲缘关系较远的情况下。因为，虽然通过体细胞杂交可以克服有性杂交障碍，但在体细胞水平上，仍会表现一定程度的不亲和，这就引起了分化、生长、发育受阻，影响生根以及生殖器官的形成。

另外，在对称融合中，由于分裂不同步等原因，常常会出现一方染色体部分或全部丢失的现象，形成非对称的融合产物。

原生质体融合后的个体称为融合体。同种原生质体间的融合称为同源融合，产生的融合体称为同核体；非同种原生质体间的融合称为异源融合，由此产生的融合体称为异核体。

b．非对称融合　非对称融合是指一方亲本（受体）的全部原生质与另一方亲本（供体）的部分核物质及胞质物质重组，产生不对称杂种。因此非对称融合需要在融合前对一方原生质体（供体）给予一定的处理，如采用纺锤体毒素、染色体浓缩剂、Y射线、X射线、紫外线等，使其染色体部分破坏后用于体细胞杂交。非对称融合只有供体方的少量染色体转入受体方细胞，故更有希望克服远缘杂交的不亲和性，并且得到的杂种植株可能更接近试验所要求的性状，减少回交次数甚至免去这一步骤，达到改良作物的目的，使育种周期大大缩短。

③ 原生质体融合方式　植物原生质体融合包括自发融合和诱发融合。

a．自发融合　在酶解分离原生质体的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体，每个同核体包含二至多个核，这种原生质体融合叫做自发融合，它是由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。在由幼嫩叶片和分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中，这种自发的多核融合体较常见。例如，在玉米胚乳愈伤组织细胞和胚悬浮细胞原生质体中，大约有50%是多核融合体。自发融合常常是人们所不期望的，在用酶溶液处理之前先使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用，则可打断胞间连丝，减少自发融合的频率。

b．诱发融合　在体细胞杂交中，彼此融合的原生质体应是不同来源的，即应形成异核体，否则是无意义的。为了实现诱发融合，需要使用适当的融合剂，首先将不同的原生质体聚集到一起，然后使其粘连，从而实现原生质体融合。融合的方法主要有用NaNO₃、高pH-高Ca^2＋、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇等处理的化学融合法，用机械法诱导粘连、电刺激等的物理融合法。

（a）NaNO₃融合法　其方法是将分离的原生质体悬浮在含有5.5% NaNO₃和10%蔗糖的混合液中，然后在35℃水浴锅中处理5min。在约1200r/min下离心5min，使原生质体下沉，收集原生质体，然后转入37℃的水浴锅中处理30min，其间大部分原生质体进行融合。再用额外含有0.1% NaNO₃的培养基轻轻取代混合液，将原生质体沉淀物轻轻打破，再用培养基洗涤2次，植板培养。

（b）高pH-高Ca^2＋融合法　将含两种原生质体的混合物放于含有0.05mol/L CaCl₂·2H₂O和0.4mol/L甘露醇（pH10.5）的溶液中，在约200r/min下低速离心3min，然后将离心管保持在37℃水浴锅中40～50min。

（c）PEG融合法　先将两种不同的原生质体以适当比例混合，用28%～58%的PEG溶液处理15～30min，然后将原生质体用培养基逐步进行清洗即可培养。PEG融合法的优点是双核异核体形成频率高、重复性好，而且对大多数细胞类型来说毒性很低。其优点是融合成本低，无需特殊设备；融合过程不受物种限制。但是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

（d）PEG-高Ca^2＋-高pH值融合法　用含有高浓度Ca^2＋（0.05mol/L CaCl₂·2H₂O）的强碱性溶液（pH值9～10）清洗PEG，从而将PEG融合法与高Ca^2＋-高pH值融合法结合在一起，建立了PEG-高Ca^2＋-高pH值融合法。具体做法是将两种不同的原生质体以适当的比例混合后，用细吸管滴于培养皿底部，使其形成小滴状，在原生质体小滴上及其周围轻轻加上PEG溶液，处理10～30min，使原生质体粘连融合，用高Ca^2＋和高pH值溶液清洗PEG，再用培养基清洗去高Ca^2＋和高pH值溶液。

（e）电融合法　具体方法是将分离得到的原生质体用0.5mol/L甘露醇溶液（可同时加入0.001mol/L CaCl₂·2H₂O）洗涤1次，1200r/min，4min离心，收集原生质体，用这种洗涤液将原生质体密度调至（2～8）×10⁴个/mL，再以适当比例混合两融合亲本的原生质体。将混合原生质体悬浮液滴入电融合小室中，先给两极以交变电流，使原生质体沿着电场方向排列成串珠状，接着就给以瞬间高强度的电脉冲，使原生质体膜局部破损而导致融合。电融合处理后，将融合产物移入培养基中，进行培养。与PEG融合比较起来，电融合不存在对细胞的毒害问题，具有融合效率高、操作简便的特点。

④ 原生质体融合的过程　两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近，在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连续状态，或是出现桥；由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。

⑤ 融合体的培养

a．融合产物的类型　融合初期不论亲缘关系远近，几乎都能形成各种融合体，因亲缘关系远近和细胞有丝分裂的同步化程度等因素，会得到几种不同类型的产物，包括异源融合的异核体，含有双亲不同比例的多核体，同源融合的同核体，不同胞质来源的异胞质体。异胞质体大多是由无核的亚原生质体与另一种有核原生质体融合而成。

亲缘关系对融合体的发育影响很大，在种内和种间融合的异核体大多数能形成杂种细胞，并形成可育的杂种植株。但在有性杂交不亲和的远缘种、属间融合，有时也能形成异核体，但在其后的分裂中，染色体往往丢失，难以得到异核体杂种植株，即使得到再生植株也往往不育，如马铃薯和番茄。

b．融合体的发育过程

（a）细胞壁融合　与原生质体的细胞壁再生过程相似，但稍滞后。培养1～2d后，在电子显微镜下便可看到融合体表面开始沉积大量纤维素微纤丝，进一步交织、堆积，几天后便形成有共同壁的双核细胞。

（b）核融合　细胞融合后得到的是一个有异核体、同核体及多核体等的混合群体。异核体双亲细胞的分裂如果同步。其后的发育有两种可能：一种是双亲细胞核进行正常的同步有丝分裂产生子细胞，子细胞的核中含有双亲的全部遗传物质；另一种是双亲细胞核的有丝分裂不同步或同步性不好，双亲之一的染色体被排斥、丢失，所产生的子细胞只含有一方的遗传物质，不能发生真正的核融合。

（c）细胞增殖　有些植物的融合细胞形成杂种细胞后，如果培养条件合适则继续分裂，形成细胞团和愈伤组织。有些植物的细胞则中途停止分裂，逐渐死亡。

⑥ 体细胞杂种选择　原生质体融合处理后的产物是同核体、异核体以及没有融合的亲本原生质体的混合群体。因此，必须采用一些有效的方法把异核体和真正的杂种植株选择出来。根据选择时期，可分为杂种细胞的选择和杂种植株的选择。

a．杂种细胞的选择

（a）互补筛选法　该方法是利用双亲细胞在生理或遗传特性方面所产生的互补作用来进行选择的。在选择性培养基上只有具互补作用的杂种细胞才能生长发育，非杂种细胞没有互补作用不能生长发育。根据互补类型的不同，又分为以下几种。

激素自养型互补（生长互补）选择法。双亲任何一方的原生质体在培养基上生长时需要添加植物生长调节剂，而异核体杂种细胞由于融合后的互补效应，自身能产生内源激素，不需要添加植物生长调节剂也能在培养基上生长发育。

白化互补选择。该种方法是利用叶绿体缺失突变体进行体细胞杂种的筛选。1977年Cocking利用能在条件培养基上生长分化的矮牵牛的白化突变体和在该培养基上只能发育成大的细胞团的野生型拟矮牵牛融合后发生的白化互补作用，在条件培养基上选择绿色愈伤组织或杂种幼苗。

营养缺陷型互补选择。借助营养缺陷突变型进行体细胞杂种的互补。烟草的硝酸还原酶缺失突变体（NR^－）因缺乏正常的硝酸还原酶，不能在硝酸盐作为唯一氮源的培养基上生长。1978年Glimelius利用表型均为NR^－、但突变位点不同的突变体进行原生质体融合，并培养在仅有硝酸盐为氮源的培养基，由于二者的互补作用，其异核体体细胞杂种恢复了正常硝酸还原酶活性。

抗性突变体互补选择。Power等（1976）利用拟矮牵牛和矮牵牛对药物抗性的差异进行杂种细胞的选择。拟矮牵牛在限定性培养基上只能形成小细胞团，不受1mg/L放线菌素-D的抑制，而矮牵牛的原生质体能分化成植株，但在上述浓度的放线菌素-D的培养基上不能生长。二者的融合体则能在含有放线菌素-D的培养基上分裂，形成完整植株。

基因互补选择。烟草的S和V两个光敏感叶绿体缺失突变体由非等位隐性基因控制，在正常光照下，生长缓慢，叶片淡绿，但将二者原生质体融合后，能形成绿色愈伤组织，并再生植株。在强光下，杂种叶片呈暗绿色，1974年Melchers据此选出了杂种植株。

（b）机械筛选法　互补选择法需要有各种突变体，然而目前在植物上还没有很多突变体可供利用，因而应用受到限制，机械分离法则不受此限制。

天然颜色标记分离。利用不同颜色的原生质体进行融合，该种方法原则上是选择那些在显微镜下能区别的两类细胞。常用的是选择含有叶绿体或其他色素质体的组织细胞作为一方，另一方选择用悬浮培养或固体培养的细胞，它们有明显的细胞质，但不含其他色素，融合后易识别。

荧光素标记分离。该方法可用于亲本间无天然色素差异的原生质体融合时异核体的分离。首先在两亲本的原生质体群体中分别导入无毒性的不同荧光染料，融合后根据两种荧光色的存在，可把异核体与同核体区分开。可利用显微操作技术挑选异核体，但难以挑选出大量异核体。

荧光活性自动细胞分类器分类融合体。用不同的荧光剂分别标记双亲的原生质体，融合后异核体应含有两种荧光标记。当混合的细胞群体通过细胞分类器时，用电子扫描确定其荧光特征并分类，对融合体可做进一步分析和培养。该仪器的结构和操作复杂。

b．杂种植株的选择

（a）形态学鉴定　该种方法是鉴定杂种的最准确的方法。根据杂种植株的表型特征进行鉴定，如株形、叶形、花色等。杂种植株的外部形态往往介于两亲本之间，与亲本有区别。如矮牵牛的花是红色，拟矮牵牛的花为白色，其体细胞杂种的花为紫色。

（b）细胞学鉴定　各种植物的染色体数目是稳定的。因此，可以利用杂种细胞中的核、染色体及细胞器的特征作为鉴定杂种的重要依据。

（c）生物化学鉴定　利用亲本的某些生化特征作为鉴定指标，主要有酶、色素、蛋白质、同工酶和二磷酸核酮糖羧化酶等。如矮牵牛和拟矮牵牛体细胞杂种植株鉴定中采用同工酶分析，发现不仅具有双亲的酶谱带，而且还出现新的杂种谱带。

（d）分子生物学鉴定　利用特异性限制性内切酶对融合体再生植株的叶绿体和线粒体基因组进行酶切和电泳分析，可确定再生植株细胞质中不同亲本细胞器DNA的组成情况，来鉴定是否为杂种植株。另外，分子杂交可提供遗传物质转移的直接证据。体细胞杂种的鉴定技术发展较快，目前在一些植物中已初步建立鉴定体系，但尚有许多问题需要解决。

（三）继代培养

通过初代培养所获得的不定芽、无菌茎梢、胚状体或原球茎等无菌材料被称为中间繁殖体。由于中间繁殖体数量有限，所以需要将它们切割、分离后转移到新的培养基中增殖，这个过程称为继代培养。继代培养是继初代培养之后的连续数代的培养过程，旨在扩繁中间繁殖体的数量，最后能达到边繁殖边生根的目的。

（四）生根与壮苗

当丛生芽苗增殖到一定数量后，要分离成单苗转入生根培养基进行生根诱导。一般认为矿质元素含量高，有利于茎叶生长，含量较低时有利于生根。所以生根培养基多采用1/2 MS或1/4 MS的培养基。同时培养基中加入适量的生长素，一般2～4d即可见根原基发生，当根长约1cm时即可驯化移栽。

同一种植物的试管苗其壮苗的移栽成活率高，因此在生根的同时培养壮苗。一般在生根培养基中添加多效唑、比久、矮壮素等一定数量的生长延缓剂或生根培养阶段将培养基中的糖含量减半，提高光强约为原来的3～6倍，一方面促进生根，促使试管苗的生活方式由异养型向自养型转变；另一方面对水分胁迫和疾病的抗性也会增强。

（五）驯化移栽

驯化移栽见项目四。

（六）组培的常见问题及预防措施

组织培养中容易出现污染、褐变、玻璃化三种现象而导致组培失败。

1．污染的原因及预防措施

（1）污染的含义、症状及原因　污染是组织培养最常见和首先要解决的问题。污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。造成污染的病原菌主要有细菌和真菌两大类。

细菌性污染的症状是菌落呈黏液状，一般接种后1～2d就能发现。造成污染的原因除材料带菌或培养基灭菌不彻底以外，操作人员的不慎也是造成细菌污染的重要原因；而真菌性污染的症状是污染部分长有不同颜色的霉菌，一般接种后3～10d后才能发现。造成污染的原因多为周围环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养瓶瓶口过大等。

（2）污染的预防措施　首先，防止外植体带菌，做好接种材料的室外采集工作。最好在春秋晴天下午采集；优先选择地上部分作为外植体；外植体采集前喷杀虫剂、杀菌剂或套袋等；接种前在室内或无菌条件下对材料进行预培养，从新抽生的枝条上选择外植体。

第二，外植体要进行严格灭菌，在正式接种或大规模组培生产前一定要进行灭菌效果试验，摸索出最佳的灭菌方法，达到最好的灭菌效果。对于难以彻底灭菌的材料可以采取多次灭菌和多种药剂交替浸泡。

第三，要对培养基和接种器具进行彻底灭菌，严格按照培养基配制要求分装、封口。培养基分装时，液体培养基不能溅留到培养瓶口；封口膜不能破损；封口时线绳要位置适当，松紧适宜。同时要保证培养基及接种用器具的灭菌时间和灭菌温度。

第四，要保持室内的环境清洁，培养室和接种室定期用消毒剂熏蒸、紫外灯照射；污染的组培材料不能随便就地清洗；定期清洗或更换超净台过滤器，并进行带菌试验；地面、墙面、工作台要及时灭菌；保持培养室清洁，控制人员频繁出入培养室。

最后，在接种时一定要严格按照无菌操作规程进行。

2．褐变及预防措施

（1）褐变的含义及原因　褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后导致外植体变褐而死亡的现象。

影响褐变的因素极其复杂，随着植物的种类、基因型、外植体的生理状态和取材季节、外植体的部位、培养基成分、培养条件、外植体大小、受伤的程度及材料转移时间等情况的不同而不同。

① 植物种类与基因型　在不同植物或同种植物不同品种的组培过程中，褐化发生的频率和严重程度存在较大差异，这是由于各种植物在所含的鞣质及其他酚类化合物的数量、多酚氧化酶活性上的差异造成的。因此，在培养过程中对容易褐变的植物，应考虑对其他不同品种同时进行培养，因此能够筛选，力争采用不褐变或褐变程度轻的外植体作为培养对象。

② 外植体的生理状态、取材季节及部位　材料本身的生理状态不同，接种后的褐变程度也不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料较成年植株上采集的植物材料褐化程度轻；幼嫩组织较老熟组织褐化程度轻。另外，处于生长季节的植物体内含有较多的酚类化合物，所以夏季时取材更容易发生褐化，冬春季节取材则材料褐化死亡率最低。因此，从防止材料褐化角度考虑，要注意取材时间和部位。

③ 培养基成分　培养基的成分也会影响褐变。如在初代培养时，无机盐浓度过高可引起酚类物质的大量产生，导致外植体褐变，降低盐浓度则可减少酚类外溢，减轻褐变；植物生长物质使用不当，如细胞分类素BA能刺激多酚氧化酶活性的提高，也会使组织培养材料褐变。

④ 培养条件　培养过程中温度过高或光照过强，均可使得多酚氧化酶活性提高，从而加速外植体的褐变。因此，采集外植体前，将材料或母株枝条作遮光处理后再切取外植体培养，能够有效抑制褐化的发生。

⑤ 外植体大小及受伤的程度　切取的材料大小、植物组织受伤程度也影响褐化。一般来说，材料太小，容易褐化；外植体受伤越重，越容易褐化。因此化学消毒剂在杀死外植体表面菌类的同时，也可能会在一定程度上杀死外植体的组织细胞，导致褐化。

⑥ 材料转移时间　培养过程中材料长期不转移，会导致培养材料褐化，以致材料全部死亡。

（2）褐变的预防措施　首先，选择适宜的外植体和最佳培养基。即选择分生能力强的外植体，培养基从无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平方面进行考虑，在适宜的温度及黑暗条件进行培养，尽可能减少褐变的发生。如在不影响外植体正常生长和分化的前提下，尽量降低温度，减少光照。

其次，对于易褐变的材料进行连续转移。如在山月桂树的茎尖培养中，接种12～24h转移到液体的培养基上，然后继续每天转一次，这样经过连续处理7～10d后，褐化现象便会得到控制或大为减轻。

第三，再在培养基中加抗氧化剂，可预防醌类物质的形成。在液体培养基中加入抗氧化剂比在固体培养基中加入的效果要好。常用的抗氧化剂有维生素C、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、半胱氨酸、硫代硫酸钠、柠檬酸、活性炭等。通常在培养基中附加0.1%～0.3%的活性炭或5～20mg/L的PVP。

3．玻璃化现象

（1）玻璃化的含义及症状　玻璃化是指当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化（也称为超水化现象）。发生玻璃化的试管苗称为玻璃化苗。

在进行植物组织培养时，经常会出现“玻璃苗”，即试管苗生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状，整株矮小肿胀，失绿，茎叶表皮无蜡质层，无功能性气孔，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。组织发育不全或畸形；体内含水量高，干物质等含量低；试管苗生长缓慢，分化能力下降，难以诱导生根，移栽成活率极低，因而繁殖系数低。

（2）玻璃化的原因　玻璃化的起因是细胞生长过程中环境的变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。引起试管苗玻璃化的因素主要有激素浓度、培养基成分、琼脂用量、温度、光照、通风条件、植物材料等。

① 激素浓度　细胞分裂素浓度过高，易导致玻璃化苗的发生。造成细胞分裂素浓度过高的原因主要有以下几种：一是培养基中一次加入细胞分裂素过多；二是细胞分裂素与生长素的比例失调，植物吸收过多细胞分裂素；三是多次继代引起细胞分裂素累加效应，玻璃化苗发生的比例增大。

② 培养基成分　培养基中无机离子的种类、浓度及其比例不适宜该种植物，则玻璃化苗的比例就会增加。

③ 琼脂用量　培养基中琼脂含量低时，玻璃化苗的比例增加，水浸状严重，苗只向上生长。虽然随着琼脂用量的增加，玻璃化苗的比例明显减少，但琼脂的含量决定培养基的硬度，琼脂加入过多培养基会太硬，影响营养吸收，使苗生长缓慢，分枝减少。

④ 温度　适宜的温度可以使试管苗生长良好，温度过高、过低或温度忽高忽低都容易形成玻璃化苗。

⑤ 光照　增加光强可促进光合作用，提高糖类的含量，使玻璃化的发生比例降低；光照不足，再加上高温，极易引发玻璃化。大多数植物在10～12h/d、1500～2000lx光强的条件下能够正常生长和分化。当每天的光照时间大于15h时，玻璃化苗的比例明显增加。

⑥ 通风条件　试管苗生长期间，要求气体交换充分、良好。气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖的种类。生长过快、容积小、培养时间长则容易出现玻璃化苗。

⑦ 植物材料　不同的植物试管苗的玻璃化程度有所差异。草本花卉和幼嫩组织相对容易发生玻璃化。对容易发生玻璃化的植物材料如果长时间浸泡在水中，则玻璃化程度尤其严重。

（3）玻璃化的预防措施　这种“玻璃苗”是植物组织培养过程中一种生理失调或生理病变，很难继续继代培养和扩繁，移栽后很难成活。目前，玻璃化的根本原因尚无定论。为解决这一问题，采取以下几项措施可使试管苗玻璃化现象在一定程度上得到减轻。

① 利用固体培养基，增加琼脂浓度，降低培养基的水势，造成细胞吸水阻遏，可降低玻璃化。

② 适当提高培养基中的蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分，造成水分胁迫。

③ 适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素浓度。适当增加培养基中无机盐的含量，降低培养基中铵态氮浓度提高硝态氮浓度。

④ 增加自然光强，延长光照时间。实验发现，玻璃苗放于自然光下几天后，茎、叶变红，玻璃化逐渐消失。因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。

⑤ 控制温度，适当低温处理，避免过高的培养温度。

⑥ 使用透气性好的封口材料。如牛皮纸、棉塞、滤纸、封口纸等，尽可能降低培养容器内空气湿度，加强气体交换。

⑦ 尽量选用玻璃化轻或无玻璃化的植物材料。

⑧ 在培养基中适当添加活性炭、间苯三酚、根皮苷、聚乙烯醇（PVA）均可有效控制玻璃化苗的发生。